本发明属于马铃薯培育，具体涉及一种马铃薯原生质体高效再生方法。
背景技术：
1、植物原生质体再生技术涉及将植物细胞的细胞壁去除形成原生质体，并通过特定的培养条件使其再生成完整的植株。马铃薯是最早成功进行离体培养并获得体细胞杂种植株的农作物之一，原生质体培养及再生是体细胞杂交的关键环节，体细胞杂交技术可以避免马铃薯因倍性水平和胚乳平衡数造成在常规育种上的难点。现有技术主要以制备具有活性的马铃薯原生质体为目的，技术成果集中于原生质体制备阶段，利用原生质体无细胞壁的特点，开展瞬时遗传转化、体细胞杂交等研究，受体材料多采用叶片，少数使用茎段、花粉、下胚轴等获得原生质体，开展后续遗传转化。
2、目前马铃薯叶片原生质体再生技术存在两个重大缺陷：一是再生不同步，导致同一批次原生质体的芽再生时间跨度大，再生芽发育时期严重不同步；二是再生率低，目前报道马铃薯叶片原生质体诱导出芽再生率最高为22.9%，但多数研究未涉及单批次再生率的分析研究。因此，亟需开发一种能够提高马铃薯原生质体同步化水平及再生率的技术。
技术实现思路
1、本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，提供一种周期短、再生率高的马铃薯原生质体高效再生方法。
2、本发明的目的由如下技术方案实施：
3、一种马铃薯原生质体高效再生方法，其包括以下步骤：
4、s1、试管苗培养；
5、s2、原生质体制备；
6、s3、愈伤组织增殖；
7、s4、愈伤同步化处理：从所述s3得到的所述愈伤组织中，筛选出直径100~1000 μm（代谢合成水平较为同步、且再生能力强）的所述愈伤组织，移入愈伤增殖培养基，再添加同步化增殖培养液，于4~7℃培养1~3 d，以增加同步化水平，然后在光照条件下于20~23℃培养16 h、在黑暗条件下于18~20℃培养8 h，如此光照、黑暗交替培养25 d后，形成绿色愈伤组织；愈伤增殖培养基是固体培养基，同步化增殖培养基是液体培养基，固液双层培养法的优点是愈伤增殖培养基中的营养物质可促进愈伤诱导成苗，同时在不更换培养基的情况下添加同步化增殖液体培养基，避免成苗组织细胞过度分裂和增生，实现同步化，有利于缩短培养时间；
8、s5、愈伤诱导再生：将所述s4得到的所述绿色愈伤组织转移至芽再生培养基培养，培养条件为在光照条件下于20~23℃培养16 h、在黑暗条件下于18~20℃培养8小时，如此光照、黑暗交替培养40 d后，分化出再生芽。
9、进一步地，所述同步化增殖培养基的ph值为5.6~6.0；所述同步化增殖培养液包括以下组分：ms培养基 4.33 g/l、甘氨酸 2 mg/l、肌醇 150 mg/l、维生素b1盐酸硫胺素 0.5mg/l、维生素b6维生素b6 0.5 mg/l、烟酸 5 mg/l、叶酸 0.5 mg/l、生物素 0.05 mg/l、蔗糖 30 g/l、甘露醇 3 g/l、硫酸腺嘌呤 40 mg/l、萘乙酸 1 mg/l、6-苄氨基腺嘌呤 0.4~1.0 mg/l、吲哚乙酸 0.5 mg/l、脱落酸 0~5 mg/l，溶剂为无菌水。
10、进一步地，所述芽再生培养基的ph值为5.6~6.0；所述芽再生培养基包括以下组分：ms培养基 4.4 g/l、蔗糖 10 g/l、玉米素或t-玉米素 1 mg/l、萘乙酸 0.01 mg/l、ga30~0.1 mg/l、琼脂 6g/l，溶剂为无菌水。
11、进一步地，所述s1包括：将马铃薯组培苗在以下条件培养3~4 w：在光照条件下于20~23℃培养16 h、在黑暗条件下于18~20℃培养8小时，如此光照、黑暗交替培养。
12、进一步地，所述s2包括：
13、s21、预培养：在无菌条件下，取所述s1培养得到的马铃薯组培苗上部充分展开的2~3个叶片，放入预处理ⅰ培养基，于24℃条件下暗培养1~5 d；然后移除所述预处理ⅰ培养基，将所述预处理ⅰ培养基培养后的叶片放入预处理ⅱ培养基，于4℃冰箱中孵育24 h；预处理ⅱ培养基中包括肌醇、mes等成分，肌醇为渗透压调节剂，有助于维持细胞内外渗透压的平衡，mes为缓冲剂，能够调节和稳定溶液的ph值；预培养步骤可以为原生质体的高效、稳定制备提供基础，有利于后续充分酶解释放叶片内的原生质体细胞；低温培养有利于保持细胞内的酶活，减缓细胞代谢速率，保持细胞结构的完整性；
14、s22、酶解处理：将所述s21中预培养后的叶片切成细条，浸入酶解液，于28℃暗孵育9~10 h；酶解后过滤，将滤液离心后去上清液；
15、s23、原生质体纯化：在所述s22离心后得到的沉淀物中加入mr培养液，悬浮原生质体，用移液器吸出，沿管壁轻轻地加入到另一含有mp培养液的离心管中，离心，收集环带状原生质体；用mps洗液将所述环带状原生质体漂洗2次；然后用e培养液悬洗一次；再用e培养液重悬并调整稀释至5×104个/ml，得到原生质体悬浮液。
16、进一步地，所述e培养液的ph值为5.6~6.0；所述e培养液包括以下组分：硝酸钾1900 mg/l、二水氯化钙 440 mg/l、七水硫酸镁 370 mg/l、磷酸二氢钾 170 mg/l、硼酸3.1 mg/l、碘化钾 0.42 mg/l、二水钼酸钠 0.13 mg/l、六水氯化钴 0.013 mg/l、四水硫酸锰 11.16 mg/l、七水硫酸锌 4.3 mg/l、五水硫酸铜 0.013 mg/l、七水硫酸亚铁 13.94mg/l、乙二胺四乙酸二钠 18.64 mg/l、维生素b1 0.5 mg/l、维生素b6 0.5 mg/l、烟酸 5.0mg/l、生物素 0.05 mg/l、甘氨酸 2.0 mg/l、叶酸 0.5 mg/l、水解酪素 100 mg/l、丙酮酸10 mg/l、dl-苹果酸 20 mg/l、柠檬酸 20 mg/l、bsa 500 mg/l、萘乙酸 0~1.0 mg/l、6-苄氨基腺嘌呤 0.4 mg/l、2,4-二氯苯氧乙酸 0~2.0 mg/l、d-甘露醇 0.15m mol/l、肌醇 50mol/l、木糖醇 125 mol/l、山梨糖醇 125 mol/l、d-纤维二糖 125 mol/l、葡萄糖 125mol/l、蔗糖 0.15 mol/l，溶剂为无菌水。
17、进一步地，所述s3包括：将所述s2制备的原生质体悬浮液于21~24℃、黑暗条件下静置培养，培养25 d后增殖为小细胞团，形成愈伤组织。
18、有益效果：本发明提供了一种马铃薯原生质体高效再生方法，以马铃薯叶片为供体材料，设计了同步化处理和诱导再生的专用培养基及培养条件，通过试管苗培养、原生质体制备、愈伤组织增殖、愈伤同步化处理、愈伤诱导再生等步骤进行马铃薯原生质体的高效再生。通过提高原生质体诱导产生愈伤的同步化水平及芽再生率，使具备目的性状的原生质体更易形成再生植株，提高植株再生率的同时缩短诱导再生的时间跨度，有利于提高马铃薯育种效率，且不受季节和地域的限制，也可用于高通量马铃薯脱毒苗生产，减少多代扩繁以及基础脱毒苗保存等生产成本。
1.一种马铃薯原生质体高效再生方法，其特征在于，其包括以下步骤：
2. 根据权利要求1所述的一种马铃薯原生质体高效再生方法，其特征在于，所述同步化增殖培养基的ph值为5.6~6.0；所述同步化增殖培养液包括以下组分：ms培养基 4.33 g/l、甘氨酸 2 mg/l、肌醇 150 mg/l、维生素b1盐酸硫胺素 0.5 mg/l、维生素b6维生素b60.5 mg/l、烟酸 5 mg/l、叶酸 0.5 mg/l、生物素 0.05 mg/l、蔗糖 30 g/l、甘露醇 3 g/l、硫酸腺嘌呤 40 mg/l、萘乙酸 1 mg/l、6-苄氨基腺嘌呤 0.4~1.0 mg/l、吲哚乙酸 0.5 mg/l、脱落酸 0~5 mg/l，溶剂为无菌水。
3. 根据权利要求1所述的一种马铃薯原生质体高效再生方法，其特征在于，所述芽再生培养基的ph值为5.6~6.0；所述芽再生培养基包括以下组分：ms培养基 4.4 g/l、蔗糖 10g/l、玉米素或t-玉米素 1 mg/l、萘乙酸 0.01 mg/l、ga3 0~0.1 mg/l、琼脂 6g/l，溶剂为无菌水。
4. 根据权利要求1所述的一种马铃薯原生质体高效再生方法，其特征在于，所述s1包括：将马铃薯组培苗在以下条件培养3~4 w：在光照条件下于20~23℃培养16 h、在黑暗条件下于18~20℃培养8小时，如此光照、黑暗交替培养。
5.根据权利要求1所述的一种马铃薯原生质体高效再生方法，其特征在于，所述s2包括：
6. 根据权利要求5所述的一种马铃薯原生质体高效再生方法，其特征在于，所述e培养液的ph值为5.6~6.0；所述e培养液包括以下组分：硝酸钾 1900 mg/l、二水氯化钙 440 mg/l、七水硫酸镁 370 mg/l、磷酸二氢钾 170 mg/l、硼酸 3.1 mg/l、碘化钾 0.42 mg/l、二水钼酸钠 0.13 mg/l、六水氯化钴 0.013 mg/l、四水硫酸锰 11.16 mg/l、七水硫酸锌 4.3mg/l、五水硫酸铜 0.013 mg/l、七水硫酸亚铁 13.94 mg/l、乙二胺四乙酸二钠 18.64 mg/l、维生素b1 0.5 mg/l、维生素b6 0.5 mg/l、烟酸 5.0 mg/l、生物素 0.05 mg/l、甘氨酸2.0 mg/l、叶酸 0.5 mg/l、水解酪素 100 mg/l、丙酮酸 10 mg/l、dl-苹果酸 20 mg/l、柠檬酸 20 mg/l、bsa 500 mg/l、萘乙酸 0~1.0 mg/l、6-苄氨基腺嘌呤 0.4 mg/l、2,4-二氯苯氧乙酸 0~2.0 mg/l、d-甘露醇 0.15m mol/l、肌醇 50 mol/l、木糖醇 125 mol/l、山梨糖醇 125 mol/l、d-纤维二糖 125 mol/l、葡萄糖 125 mol/l、蔗糖 0.15 mol/l，溶剂为无菌水。
7. 根据权利要求1所述的一种马铃薯原生质体高效再生方法，其特征在于，所述s3包括：将所述s2制备的原生质体悬浮液于21~24℃、黑暗条件下静置培养，培养25 d后增殖为小细胞团，形成愈伤组织。
