本发明属于生物。本发明涉及用于产生脱辅基类胡萝卜素(apocarotenoid)的改进方法。特别是，本发明涉及利用基因修饰宿主生物生物合成α-紫罗兰酮。序列表本申请包含序列表，该序列表已以xml格式以电子方式提交，并据此通过引用整体并入。所述xml拷贝创建于2023年3月1日，命名为78696sg2_sequence listing.xml，大小为20kb。
背景技术：
1、脱辅基类胡萝卜素是一类由类胡萝卜素氧化裂解生成的化合物。脱辅基类胡萝卜素广泛分布于细菌、真菌、植物和动物中。脱辅基类胡萝卜素具有多种生物学功能，并且是激素(脱落酸、独脚金内酯)、色素、信号化合物和芳香化合物的前体。这些类胡萝卜素衍生芳香化合物包括紫罗兰酮(α-和β-紫罗兰酮)，紫罗兰酮是一组由13个碳组成的天然酮类化合物，具有单环萜类主链，存在于各种花卉和水果中，包括玫瑰、桂花、鸢尾根和覆盆子。α-和β-紫罗兰酮是通过类胡萝卜素裂解加氧酶氧化α-胡萝卜素或ε-胡萝卜素等类胡萝卜素而产生的。特别是，α-紫罗兰酮具有紫罗兰般的香气、覆盆子和黑莓的气味以及0.4-3.2ppb(十亿分之几)的极低气味阈值。α-紫罗兰酮的这些特性使其在香精香料工业中得到了广泛应用。
2、α-紫罗兰酮具有很高的商业价值和需求，但由于其丰度极低，从天然材料中规模提取不可行，因此商业α-紫罗兰酮的生产主要通过化学合成。
3、因此，有必要改进现有的脱辅基类胡萝卜素生物合成方法，以实现较高的产率。
技术实现思路
1、一方面，提供了包含一个或多个载体的宿主细胞，该载体包含编码以下的多核苷酸序列：
2、甲羟戊酸途径的一个或多个基因；
3、番茄红素途径的一个或多个基因；
4、α-紫罗兰酮途径的一个或多个基因；以及
5、一个或多个氢过氧化物还原酶或过氧化氢酶基因。
6、另一方面，提供了产生一种或多种脱辅基类胡萝卜素的方法，包括在培养基中培养本文所述的宿主细胞。
7、另一方面，提供了用于产生一种或多种脱辅基类胡萝卜素的试剂盒，其中该试剂盒包括本文所述的宿主细胞和使用说明。
8、定义
9、本文所用术语“类胡萝卜素”是指一类由植物、动物、藻类和微生物合成的天然存在的色素。类胡萝卜素具有富含电子、带有9个或更多共轭键的多烯链结构，并具有光保护、光捕获和抗氧化剂特性。
10、本文所用术语“脱辅基类胡萝卜素”是指一类通过酶催化的氧化裂解从类胡萝卜素衍生的天然存在的化合物。这些酶是类胡萝卜素裂解双加氧酶(carotenoid cleavagedioxygenase,ccd)。
11、本文所用术语“变体”是指dna序列的修饰。dna序列的修饰包括突变、截短、易位、取代、缺失和插入，从而导致基因活性改变。
12、dna区域通常位于基因转录起始位点附近和dna上游。启动子可以是诱导型的或非诱导型的。本文所用的术语“诱导型启动子”是指可以响应于特定刺激物(也称为诱导剂)而受到调节的启动子。启动子系统经修饰可以成为诱导型的。诱导型启动子系统的实例包括tet-on系统、tet-off系统、t7系统、trp系统、tac系统、λci857-pl系统、细菌el222系统以及lac系统。启动子也可以是组成型启动子，该启动子是始终有活性的启动子。
13、本文所用术语“过表达”，在基因或蛋白质的语境中，是指基因或蛋白质表达的增加。过表达也可以指在基因不表达的情况下基因的表达。通常应当理解的是，基因或蛋白质的过表达是相对于基因或蛋白质的基线表达。基因或蛋白质的基线表达将理解为是指未突变基因或野生型基因的表达水平，或者在基因不表达的情况下，是指背景/噪音的表达水平。在这种情况下，ahpc/f或katg是过表达的，并且应当理解的是，相对于宿主细胞中ahpc/f和katg的基础水平，ahpc/f和katg的表达增加(即ahpc/f和katg的额外拷贝)。
14、本文所用术语“约”，在成分浓度和化合物百分比的语境中，通常是指所述值的+/-5％，所述值的+/-4％，更通常是指所述值的+/-3％，更通常是指所述值的+/-2％，甚至更通常是指所述值的+/-1％，以及甚至更通常是指所述值的+/-0.5％。在整个本公开中，可以以范围格式公开某些实施方案。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应解释为对所公开范围的僵硬限制。因此，对范围的描述应认为已经具体地公开了该范围内所有可能的子范围以及单个数值。例如，对范围1-6的描述应当认为已经具体公开了该范围内的1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等子范围，以及1、2、3、4、5和6等单个数字。无论范围有多大，这一点都适用。
1.宿主细胞，包含一个或多个载体，所述载体包含编码以下的多核苷酸序列：
2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述甲羟戊酸途径的一个或多个基因选自hmgs、atob、hmgr、mevk、pmk、pmd和idi，其中所述hmgr基因任选地是截短的。
3.根据权利要求1或2所述的宿主细胞，其中所述番茄红素途径的一个或多个基因选自crtbi、crtb、crti、法尼基二磷酸合酶基因和香叶基香叶基二磷酸合酶(ggpps)基因。
4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其中所述ggpps基因分离自原核生物，其中所述原核生物是包括詹氏甲烷球菌(methanocaldococcus jannaschii)或海沼甲烷球菌(methanococcus maripaludis)的古菌，或包括甲烷杆菌(methanobacterium)或耐放射异常球菌(deinococcus radioduran)的细菌。
5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其中所述细菌是甲烷杆菌。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的宿主细胞，其中所述α-紫罗兰酮途径的一个或多个基因选自番茄红素环化酶基因和ccd基因。
7.根据权利要求1-6中任一项所述宿主细胞，其中所述一个或多个载体还包含编码所述α-紫罗兰酮途径的一个或多个额外类胡萝卜素裂解双加氧酶(ccd)基因的多核苷酸序列。
8.根据权利要求6或7所述的宿主细胞，其中所述ccd基因是ccd1或ccd4基因，或其组合。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中一个或多个所述ccd1基因分离自选自以下植物：桂花(osmanthus fragrans)、拟南芥(arabidopsis thaliana)、葡萄(vitis vinifera)和碧冬茄(petunia hybrid)或其组合。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其中一个或多个所述ccd1基因分离自桂花，任选地其中一个或多个分离自桂花的ccd1基因(ofccd1)与n末端融合伴侣融合，任选地其中一个或多个所述ofccd1基因包含seq id no:1所示的多肽序列。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其中一个或多个所述ofccd1基因在活性位点的环上发生突变，任选地其中所述突变位于一个或多个氨基酸位置，任选地其中一个或多个突变包含seq id no:2所示的多核苷酸序列。
12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其中所述突变是第425位的赖氨酸被丝氨酸取代、第424位的天冬氨酸被天冬酰胺取代和第428位的赖氨酸被丙氨酸取代。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的宿主细胞，其中所述ofccd1基因中的一个或多个是截短的。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的宿主细胞，其中所述n末端融合伴侣选自小泛素样修饰蛋白、麦芽糖结合蛋白和硫氧还蛋白(trxa)，任选地其中所述n末端融合伴侣是trxa。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的宿主细胞，其中所述ofccd1和trxa基因中的一个或多个是过表达的。
16.根据权利要求6-15中任一项所述的宿主细胞，其中所述番茄红素环化酶基因是番茄红素ε-环化酶(lcye)基因。
17.根据权利要求16所述的宿主细胞，其中所述lcye基因分离自选自以下的植物：莴苣(lactuca sativa)、拟南芥、烟草(nicotiana tabacum)和结球甘蓝(brassica oleraceavar.capitata)。
18.根据权利要求16或17所述的宿主细胞，其中所述分离自莴苣的lcye基因在n末端是截短的。
19.根据权利要求18所述的宿主细胞，其中所述lcye从第1-50位氨基酸被截短，任选地其中截短的lcye包含seq id no:3所示的多核苷酸序列。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的宿主细胞，其中所述氢过氧化物还原酶或过氧化氢酶基因分离自原核生物，任选地其中所述原核生物是大肠杆菌(escherichia coli)。
21.根据权利要求20所述的宿主细胞，其中所述分离自大肠杆菌的氢过氧化物还原酶是烷基氢过氧化物还原酶(ahpc/f)，其中分离自大肠杆菌的所述过氧化氢酶是过氧化氢酶g(katg)。
22.根据权利要求21所述的宿主细胞，其中所述katg或ahpc/f是过表达的。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的宿主细胞，其中所述一个或多个基因可操作地连接于一个或多个诱导型启动子，其中所述诱导型启动子是t7启动子，任选地其中所述t7启动子是野生型t7启动子的变体。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞经修饰不表达至少一个参与氨基酸合成的基因。
25.根据权利要求24所述的宿主细胞，其中所述至少一个参与氨基酸合成的基因是aroa、arob、aroc和serc。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
27.根据权利要求26所述的宿主细胞，其中所述细菌细胞是大肠杆菌细胞。
28.产生一种或多种脱辅基类胡萝卜素的方法，包括在培养基中培养权利要求1-27中任一项所述的宿主细胞。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述一种或多种脱辅基类胡萝卜素选自α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、ψ-紫罗兰酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、羟基紫罗兰酮、视黄醇和视网醛。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述培养基包含诱导剂和一种或多种碳底物，任选地其中所述培养基包含至少一种抗生素。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述诱导剂是iptg或乳糖，其中所述一种或多种碳底物是葡萄糖、甘油或两者，并且其中所述至少一种抗生素选自氨苄西林、氯霉素、卡那霉素和壮观霉素。
32.根据权利要求28-31中任一项所述的方法，其中以约50rpm至约2000rpm的振荡速度，在所述培养基中培养所述宿主细胞。
33.根据权利要求28-32中任一项所述方法，其中在补料分批发酵培养基中α-紫罗兰酮的产率为至少500mg/l，任选地其中α-紫罗兰酮的产率为至少700mg/l。
34.根据权利要求28-33中任一项所述的方法，其中通过每od600的滴度(滴度/od600)，测量烧瓶中的批量培养基和补料分批发酵培养基中α-紫罗兰酮的产率，任选地其中所述每od600的滴度为约3-5mg/l/od600。
35.用于产生一种或多种脱辅基类胡萝卜素的试剂盒，其中所述试剂盒包括权利要求1-27中任一项所述的宿主细胞和使用说明。
36.根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述宿主细胞溶解于溶液中或是冻干的。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述宿主细胞通过深度冷冻保存。
