背景技术：
1、本领域需要修饰性多核苷酸以改善生物体的表型和基因型；特别是用于农业应用以改良植物，例如农作物。
2、分体病毒(pv)是具有分开衣壳化的二分基因组的dsrna病毒。一个(pv)基因组包含编码rna依赖性rna聚合酶的dsrna，并且另一个pv基因组包含编码衣壳蛋白的dsrna(roossinck,m.doi/10.1111/nph.15364)。
技术实现思路
1、提供了包含第一启动子的重组dna分子，所述第一启动子与编码rna分子的dna可操作地连接，其中所述rna分子从5’末端至3’末端包含：(a)由分体病毒rna依赖性rna聚合酶(rdrp)识别的5’rna复制元件；(b)货物rna分子；以及(c)由所述rdrp识别的3’rna复制元件；其中所述5’rna复制元件、所述货物rna分子和所述3’rna复制元件可操作地连接，其中所述启动子和所述货物rna分子与所述5’rna复制元件和所述3’rna复制元件是异源的。还提供了细胞，载体，以及包含重组dna分子、载体或细胞的农业配制品。还提供了表达系统，其包含重组dna分子和含有所述重组dna分子和识别由dna分子编码的5’和3’rna复制元件的rdrp蛋白的细胞。还提供了向植物提供合成的分体病毒卫星rna的方法，所述方法包括使所述植物与重组dna分子、细胞、载体或其农业配制品接触。提供了在植物或植物细胞中产生外源多肽的方法，所述方法包括提供包含重组dna分子的植物或植物细胞，其中由所述dna分子编码的货物rna分子包含编码所述外源多肽的可翻译信使rna，其中所述植物或植物细胞包含识别重组rna的5’rna复制元件和3’rna复制元件并且催化合成的分体病毒卫星rna从所述重组rna分子的合成的rdrp蛋白，并且其中所述外源多肽从所述可翻译信使翻译。
2、还提供了重组rna分子，其从5’末端至3’末端包含：(a)由分体病毒rna依赖性rna聚合酶(rdrp)识别的5’rna复制元件；(b)货物rna分子；以及(c)由所述rdrp识别的3’rna复制元件，其中所述5’rna复制元件、所述货物rna分子和所述3’rna复制元件可操作地连接，并且其中所述货物rna分子与所述5’rna复制元件和所述3’rna复制元件是异源的。还提供了包含重组rna分子的农业配制品和细胞。还提供了表达系统，其包含：(a)含有所述重组rna分子的rna分子；以及(b)含有所述重组rna分子和识别所述重组rna分子的5’和3’rna复制元件的rdrp蛋白的细胞。提供了包含重组rna分子和分体病毒rdrp的植物繁殖体。提供了包含含有重组rna分子和分体病毒rdrp的至少一个植物细胞的植物繁殖体。提供了产生经修饰的植物繁殖体的方法，所述植物繁殖体包含含有所述重组rna分子的至少一个植物细胞，所述方法包括从包含含有所述重组rna分子的植物细胞和缺乏所述重组rna分子的植物细胞的植物细胞混合群体中分离包含含有所述重组rna分子和分体病毒rna依赖性rna聚合酶(rdrp)的至少一个植物细胞的植物繁殖体。还提供了向植物提供合成的分体病毒卫星rna的方法，所述方法包括使所述植物与重组rna分子接触。提供了获得植物或植物细胞中的表型变化的方法，所述方法包括向植物或植物细胞提供重组rna分子，其中所述货物rna分子包含在所述植物或植物细胞中与缺乏所述重组rna的植物或植物细胞相比实现表型变化的rna，其中所述植物或植物细胞包含识别所述5’rna复制元件和3’rna复制元件并且催化合成的分体病毒rna从所述重组rna分子的合成的rdrp蛋白，并且所述货物rna分子实现所述表型变化。提供了增加植物对有害生物或病原体的抗性的方法，所述方法包括向植物提供重组rna分子，其中所述货物rna分子实现与缺乏所述重组rna分子的植物相比所述植物对有害生物或病原体的抗性的增加，并且其中所述植物或植物细胞包含识别所述重组rna的5’rna复制元件和3’rna复制元件并且催化合成的分体病毒卫星rna从重组rna分子的合成的rdrp蛋白。提供了增加植物对胁迫的抗性的方法，所述方法包括向植物提供重组rna分子，其中所述植物包含识别所述重组rna的5’rna复制元件和3’rna复制元件并且催化合成的分体病毒卫星rna从重组rna分子的合成的rdrp蛋白，并且其中所述货物rna分子实现与缺乏所述重组rna分子的植物相比所述植物对胁迫的抗性的增加。提供了制造合成的分体病毒卫星颗粒的方法，所述方法包括：(a)向植物细胞提供前述重组rna分子中的至少一个，其中所述重组rna分子包含衣壳化识别元件(ere)，并且其中所述植物细胞包含rdrp蛋白和病毒衣壳蛋白，所述rdrp蛋白识别所述5’rna复制元件和3’rna复制元件并且催化合成的分体病毒卫星rna从所述重组rna分子的合成，其中所述ere提供病毒衣壳蛋白对所述rna的衣壳化；以及任选地(b)从所述植物细胞、包含所述植物细胞的植物、或从所述植物细胞或所述植物在其中生长的培养基中分离所述合成的分体病毒卫星颗粒。还提供了制造合成的分体病毒卫星颗粒的方法，所述方法包括在容器中将前述重组rna分子与病毒衣壳蛋白组合，其中所述重组rna分子包含衣壳化识别元件(ere)，并且其中所述ere在所述容器中提供所述病毒衣壳蛋白对所述rna的衣壳化；任选地其中所述方法进一步包括从所述容器中的未组合的rna和/或病毒衣壳蛋白中分离所述合成的分体病毒卫星颗粒。提供了向植物提供合成的分体病毒卫星rna的方法，所述方法包括：将接穗嫁接到包含重组rna分子的砧木上，其中所述砧木和/或所述接穗中的至少一个细胞包含分体病毒rdrp。提供了用于产生将重组rna分子传递到子代植物或种子的植物的方法，所述方法包括从获得自包含所述重组rna分子的亲本植物的f1植物或种子的群体中分离包含含有分体病毒rna依赖性rna聚合酶(rdrp)和所述重组rna分子的至少一个细胞的f1子代植物或种子。
1.一种重组rna分子，其从5’末端至3’末端包含：
2.如权利要求1所述的重组rna分子，其中：
3.如权利要求1所述的重组rna分子，其中：
4.如权利要求3所述的重组rna分子，其中所述rna二级结构通过以下来维持：用将不会碱基配对的核苷酸取代所述二级结构中未碱基配对的核苷酸和/或用将会碱基配对的核苷酸取代所述二级结构中碱基配对的核苷酸。
5.如权利要求1所述的重组rna分子，其中：
6.如权利要求1所述的重组rna分子，其中所述rna分子进一步包含以下中的至少一个：(i)trna样元件，任选地其中所述trna样元件提供所述rna的细胞间移动，并且任选地其中所述细胞间移动由病毒移动蛋白(mp)介导；(ii)衣壳化识别元件(ere)，任选地其中所述ere通过分体病毒衣壳蛋白提供所述rna的衣壳化，或任选地其中所述ere通过非分体病毒衣壳蛋白提供所述rna的衣壳化；(iii)rna效应子；和/或(iv)编码病毒移动蛋白(mp)的rna，任选地其中内部核糖体进入位点(ires)与所述编码mp的rna可操作地连接。
7.如权利要求6所述的重组rna分子，其中所述trna样元件包含来自拟南芥ft mrna的trna样分子，或是选自seq id no:184–231的trna样序列，或是与选自由seq id no:184–231组成的组的支架trna样序列具有至少90％序列同一性并且维持所述支架trna样序列的二级结构的经修饰的trna样序列，并且/或者其中所述ere是烟草花叶病毒(tmv)oas。
8.如权利要求1所述的重组rna分子，其中所述货物rna分子的长度高达约3.2kb。
9.如权利要求1所述的重组rna分子，其中所述货物rna分子包含：(a)至少一个编码序列，任选地其中所述编码序列编码可选择或可评分标志物；(b)至少一个非编码序列；或(c)至少一个编码序列和至少一个非编码序列两者。
10.如权利要求24所述的重组rna分子，其中所述货物rna分子包含至少一个编码序列，并且其中所述rna分子进一步包含与至少一个编码序列可操作地连接的内部核糖体进入位点(ires)，任选地其中所述可操作地连接的ires位于所述编码序列的5’并且与其紧邻。
11.如权利要求24所述的重组rna分子，其中所述货物rna分子包含至少一个非编码序列，并且其中所述至少一个非编码序列是发夹rna(hprna)；形成多个茎环的rna；rna假结；形成至少部分双链rna的rna分子；小干扰rna(sirna)或sirna前体；微小rna(mirna)或mirna前体；分阶段的rna或分阶段的rna前体；核酶；配体响应性核酶(适体酶)；rna适体；或长非编码rna(lncrna)。
12.如权利要求1所述的重组rna分子，其进一步包含含有编码至少一个核酶的rna，任选地其中所述至少一个核酶位于所述5’rna复制元件的5’或所述3’rna复制元件的3’。
13.如权利要求1所述的重组rna分子，其进一步包含含有至少一个配体响应性核酶(适体酶)的rna分子，任选地其中所述至少一个配体响应性核酶位于所述5’rna复制元件的5’或所述3’rna复制元件的3’。
14.如权利要求1所述的重组rna分子，其中：(i)所述rna进一步包含其反向互补rna分子的至少一个区段；和/或(ii)所述重组rna分子与一种或多种rna结合蛋白复合或者被病毒衣壳蛋白衣壳化，任选地其中所述病毒衣壳蛋白是分体病毒衣壳蛋白，任选地其中所述rna包含提供所述分体病毒衣壳蛋白对所述rna的衣壳化的ere，并且/或者任选地其中所述rna结合蛋白包含rna识别基序。
15.一种农业配制品，其包含如权利要求1至14中任一项所述的重组rna分子。
16.如权利要求15所述的农业配制品，其中所述重组rna分子与一种或多种rna结合蛋白复合或者被病毒衣壳蛋白衣壳化，任选地其中所述病毒衣壳蛋白是分体病毒衣壳蛋白，并且任选地其中所述rna包含提供所述分体病毒衣壳蛋白对所述rna的衣壳化的ere。
17.如权利要求15所述的农业配制品，其中所述rna结合蛋白包含rna识别基序。
18.如权利要求15所述的农业配制品，其中所述病毒衣壳蛋白与所述分体病毒是异源的。
19.如权利要求15所述的农业配制品，其中所述配制品包含所述重组rna分子和载剂、赋形剂和/或佐剂。
20.一种细胞，其包含如权利要求1至14中任一项所述的重组rna分子。
21.如权利要求20所述的细胞，其中所述细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞。
22.如权利要求20所述的细胞，其中所述细胞包含编码所述重组rna分子的重组dna分子。
23.一种表达系统，其包含：
24.如权利要求23所述的表达系统，其中所述重组rna分子包含由病毒衣壳蛋白识别的可操作地连接的衣壳化识别元件(ere)，并且其中所述细胞含有所述病毒衣壳蛋白。
25.如权利要求23所述的表达系统，其中所述衣壳化识别元件(ere)是分体病毒ere，其中所述细胞中的所述病毒衣壳蛋白是分体病毒衣壳蛋白，并且其中所述rna分子被所述分体病毒衣壳蛋白衣壳化。
26.如权利要求23所述的表达系统，其进一步包含所述重组rna分子的反向互补序列。
27.如权利要求23所述的表达系统，其中所述细胞是细菌细胞、植物细胞、真菌细胞或动物细胞。
28.如权利要求23所述的表达系统，其中所述细胞进一步包含：(i)病毒衣壳蛋白(cp)；(ii)可以与所述rna分子结合的rna结合蛋白(rbp)，任选地其中所述rbp与rna效应子结合；(iii)切割所述rna分子的rna切割剂；(iv)识别所述rna分子中的rna启动子的rna启动子依赖性rna聚合酶(rpdrp)蛋白；和/或(iv)病毒移动蛋白(mp)。
29.如权利要求28所述的表达系统，其中所述cp、rbp、rpdrp和/或所述mp：(a)由所述细胞中的重组dna分子表达；(b)外源地提供给所述细胞；(c)由所述细胞中的重组rna分子表达；或(d)由所述细胞中的病毒表达。
30.如权利要求28所述的表达系统，其中所述rdrp、cp、rbp、rpdrp和/或所述mp蛋白与所述细胞是异源的。
31.如权利要求23所述的表达系统，其中所述rdrp蛋白或编码所述rdrp蛋白的多核苷酸(a)由所述细胞中的重组dna分子表达；(b)外源地提供给所述细胞；(c)由所述细胞中的重组rna分子表达；或(d)由所述细胞中的病毒表达。
32.如权利要求23所述的表达系统，其中所述细胞是植物细胞。
33.如权利要求32所述的表达系统，其中所述植物细胞含有分体病毒，所述分体病毒表达识别所述5’rna复制元件和所述3’rna复制元件的所述rdrp蛋白。
34.如权利要求33所述的表达系统，其中所述分体病毒天然存在于所述植物细胞中。
35.一种向植物提供合成的分体病毒卫星rna的方法，所述方法包括使所述植物与如权利要求1至14中任一项所述的重组rna分子接触。
36.如权利要求35所述的方法，其中接触包括用所述重组rna分子或所述配制品喷雾、喷粉、注射或浸泡。
37.一种在植物细胞中建立合成的分体病毒卫星rna的方法，所述方法包括：向植物细胞提供如权利要求1至14中任一项所述的重组rna分子；
38.如权利要求37所述的方法，其中所述植物细胞包含分体病毒，并且其中所述rdrp蛋白通过所述分体病毒提供给所述植物细胞。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述分体病毒是所述植物细胞特有的，任选地其中所述植物细胞特有的所述分体病毒是非致病性的和/或共生的。
40.如权利要求37所述的方法，其中所述衣壳蛋白包含分体病毒衣壳蛋白，并且所述ere由所述分体病毒衣壳蛋白识别，任选地其中所述重组rna分子包含由病毒衣壳蛋白识别的可操作地连接的衣壳化识别元件(ere)。
41.一种获得植物或植物细胞中的表型变化的方法，所述方法包括：向植物或植物细胞提供如权利要求1至14中任一项所述的重组rna分子，其中所述货物rna分子包含在所述植物或植物细胞中与缺乏所述重组rna的植物或植物细胞相比实现表型变化的rna，其中所述植物或植物细胞包含rdrp蛋白，所述rdrp蛋白识别所述5’rna复制元件和3’rna复制元件并且催化合成的分体病毒rna从所述重组rna分子的合成，并且所述货物rna分子实现所述表型变化。
42.如权利要求41所述的方法，其中实现所述植物或植物细胞中的表型变化的所述rna包含选自sirna或sirna前体、mirna或mirna前体以及分阶段的sirna或分阶段的sirna前体的至少一种rna。
43.如权利要求41所述的方法，其中实现所述植物或植物细胞中的表型变化的所述rna包含信使rna。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述信使rna包含所述植物或植物细胞的基因组中不存在的rna分子。
45.如权利要求41所述的方法，其中实现所述植物或植物细胞中的表型变化的所述rna包含用于修饰所述植物或植物细胞的所述基因组的rna。
46.如权利要求41所述的方法，其中实现所述植物或植物细胞中的表型变化的所述rna包含用于修饰所述植物或植物细胞的转录组和/或表观基因组的rna，任选地其中所述用于修饰所述表观基因组的rna靶向用于rna诱导的转录沉默的内源植物基因。
47.如权利要求41所述的方法，其中所述表型变化包括所述植物对有害生物或病原体的抗性的增加，任选地其中所述有害生物或病原体选自包含以下的组：细菌、除分体病毒以外的病毒、真菌、卵菌和无脊椎动物。
48.如权利要求41所述的方法，其中所述表型变化包括所述植物对胁迫的抗性的增加，任选地其中所述胁迫包括含有营养胁迫、光胁迫、水胁迫、热胁迫和/或冷胁迫的至少一个非生物胁迫，或任选地其中所述胁迫包括含有拥挤、遮荫或化感作用的至少一个生物胁迫。
49.如权利要求41至48中任一项所述的方法，其中将所述重组rna分子以rna、衣壳化的rna或其配制品的形式提供给所述植物或植物细胞。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述衣壳化的rna包含合成的分体病毒卫星颗粒。
51.如权利要求41至48中任一项所述的方法，其中所述提供包括使所述植物或植物细胞与所述rna、衣壳化的rna或其配制品接触，任选地其中接触包括用所述rna、衣壳化的rna或其配制品喷雾、喷粉、注射或浸泡所述植物或植物细胞。
52.如权利要求41至48中任一项所述的方法，其中所述重组rna进一步包含其反向互补rna分子。
53.一种制造合成的分体病毒卫星颗粒的方法，所述方法包括将如权利要求1至14中任一项所述的重组rna分子与病毒衣壳蛋白组合，其中所述重组rna分子包含衣壳化识别元件(ere)，并且其中所述ere提供所述病毒衣壳蛋白对所述rna的衣壳化。
54.如权利要求53所述的方法，其中在容器中将所述重组rna分子与病毒衣壳蛋白组合。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述组合包括
56.如权利要求53所述的方法，所述方法进一步包括配制所述合成的分体病毒卫星颗粒的步骤，其中所述配制包括将所述合成的分体病毒卫星颗粒与载剂、赋形剂和/或佐剂组合。
57.一种植物繁殖体，其包含如权利要求1至14中任一项所述的重组rna分子和分体病毒rdrp。
58.如权利要求57所述的植物繁殖体，其中所述植物繁殖体是种子、幼苗、根、茎、叶、芽、块茎、根茎、匍匐茎、鳞茎、外植体、胚或愈伤组织。
59.如权利要求57所述的植物繁殖体，其中所述植物繁殖体是包含含有所述重组rna分子的植物细胞和缺乏所述重组rna分子的植物细胞的嵌合体。
60.如权利要求57所述的植物繁殖体，其中所述植物繁殖体缺乏编码所述重组rna分子的dna。
61.一种植物，其包含如权利要求1至14中任一项所述的重组rna分子和分体病毒rdrp。
62.如权利要求61所述的植物，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
63.如权利要求61所述的植物，其中所述植物属于菊科、葫芦科、豆科、禾本科或茄科。
64.如权利要求61所述的植物，其中所述植物缺乏编码所述重组rna分子的dna。
65.如权利要求61所述的植物，其中所述植物包含分体病毒，并且其中所述分体病毒rdrp通过所述分体病毒提供给所述植物细胞，任选地其中所述分体病毒rdrp包含与seq idno:272-275或276至290、384或390具有至少85％、90％、95％、97％或99％序列同一性的蛋白质。
66.如权利要求61所述的植物，其中所述分体病毒是所述植物特有的，任选地其中所述特有的分体病毒是非致病性的和/或共生的。
67.如权利要求61所述的植物，其中所述分体病毒rdrp、所述5’复制元件和/或所述3’复制元件衍生自包含所述分体病毒rdrp、5’复制元件和/或3’复制元件中的一个或两个的分体病毒。
68.如权利要求61所述的植物，其中所述rdrp与seq id no:272-275或276至290、384或390具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性，其中所述5’复制元件与由seq idno:2-34、70-88、372、374、376、378、380、382或386编码的所述rna具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性，并且/或者其中所述3’复制元件与由seq id no:2-34、70-88、372、374、376、378、380、382或386编码的所述rna具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性。
69.如权利要求61所述的植物，其中所述植物是嫁接的植物，并且其中所述嫁接的植物的砧木和/或接穗包含含有所述重组rna和所述分体病毒rdrp的至少一个细胞。
70.如权利要求62所述的植物，其中所述植物不是通过基本的生物过程产生的。
71.一种分体病毒卫星系统，其当引入植物或植物细胞时可以自我复制，所述分体病毒卫星系统包含：(1)重组分体病毒卫星rna，其从5’末端至3’末端包含：(a)由分体病毒rna依赖性rna聚合酶(rdrp)识别的5’rna复制元件；(b)货物rna分子；以及(c)由所述rdrp识别的3’rna复制元件；其中所述5’rna复制元件、所述货物rna分子和所述3’rna复制元件可操作地连接，并且其中所述启动子和所述货物rna分子与所述5’rna复制元件和所述3’rna复制元件是异源的；和(2)能够在所述植物或植物细胞中复制并编码识别所述重组分体病毒卫星rna中的5’和3’复制酶识别序列的所述分体病毒rdrp的外源分体病毒。
72.如权利要求71所述的自我复制分体病毒卫星系统，其中所述外源分体病毒对于植物的不同物种、品种或种质而言是特有的或天然的。
