本发明涉及生物分子分离领域。更具体地，本发明涉及用于亲和色谱的分离基质，以及基于κ轻链的存在分离生物分子，诸如免疫球蛋白和免疫球蛋白级分。本发明还涉及使用所述分离基质的方法。
背景技术：
1、免疫球蛋白和免疫球蛋白片段代表全世界生产或开发的最普遍的生物制药产品。对于这种特定治疗市场的高商业需求以及因此的价值已导致将重心放在制药公司上，控制相关成本的同时最大化它们各自的生产过程的生产率。
2、亲和色谱(典型地在包含葡萄球菌属蛋白a或其变体的基质上)通常用作完整免疫球蛋白分子纯化中的关键步骤之一。蛋白a与免疫球蛋白的fc链的高度选择性结合提供了杂质和污染物的清除率非常高的一般步骤。
3、对于缺少fc链但具有1、3或4亚类κ轻链的免疫球蛋白片段或抗体片段如fab、单链可变片段(scfv)、双特异性t细胞衔接子(bite)、结构域抗体等，包含源自大芬戈尔德氏菌(finegoldia magna)(先前称为大消化链球菌(peptoscoccus magnus))的蛋白l的基质(blj.biol.chem.264,19740-19746,1989；w kastem等:j.biol.chem.267,12820-12825,1992；b hk nilson等:j.biol.chem.267,2234-2239,1992；和美国专利6,822,075)显示出作为提供所需的高选择性的纯化平台的巨大前景。
4、蛋白l基质是可商购的，例如作为来自cytivatm的captotml，并且可以用于分离含κ轻链的蛋白质，诸如完整抗体、fab片段、scfv片段、结构域抗体等。健康人产生的抗体中约75％具有κ轻链，且治疗性单克隆抗体和抗体片段中约90％含有κ轻链(carter,p.,lazar,g.next generation antibody drugs:pursuit of the'high-hanging fruit'.nat revdrug discov 17,197–223(2018).https://doi.org/10.1038/nrd.2017.227)。
5、任何生物过程色谱应用都需要全面关注杂质和/或污染物的明确去除。这类杂质和/或污染物可以是例如在色谱程序中吸附到固定相或基质的未洗脱分子，诸如不希望的生物分子或微生物，包括例如蛋白质、碳水化合物、脂质、细菌和病毒。从基质中去除这类杂质和/或污染物通常在首次洗脱所需产物之后进行，以便在随后使用之前再生基质。这种去除通常包括称为原位清洁(cip)的程序，其中使用能够使杂质失活或从固定相洗脱杂质的试剂。通常与色谱介质一起使用的一类这样的试剂是碱性溶液，其在基质上通过。目前，最广泛使用的清洁和消毒剂是naoh，并且根据污染和杂质的程度和性质，希望以在0.05m至例如1m范围内的浓度使用naoh。然而，与例如蛋白a相比，蛋白l是一种对碱相当敏感的蛋白质，并且在数次循环中仅耐受至多约15mm的naoh。这意味着，为了确保充分的清洁，可能还必须使用额外的、不太理想的清洁溶液，例如尿素或胍盐。
6、因此，本领域仍然需要获得对碱性清洁程序具有改进的稳定性的含有源自蛋白l的配体的分离基质。
技术实现思路
1、根据第一方面，本公开提供了一种分离基质，所述分离基质包含至少12mg/ml共价偶联至多孔载体的κ轻链结合配体，其中所述κ轻链结合配体包含碱稳定的大芬戈尔德氏菌(先前称为大消化链球菌)蛋白l结构域的多聚体，基本上由其组成，或由其组成；并且所述多孔载体包含聚合物颗粒，所述聚合物颗粒具有50-200mg/ml的干固体重量(dw)、30-100μm的体积加权中值直径(d50v)。
2、根据上文的分离基质可以包含至少14mg/mlκ轻链结合配体，诸如至少14.5mg/ml、至少15mg/ml、至少15.5mg/ml、至少16mg/ml、至少16.5mg/ml、至少17mg/ml、至少17.5mg/ml、至少18mg/ml、至少18.5mg/ml或至少19mg/mlκ轻链结合配体。
3、多孔载体的dw可以是50-150mg/ml、50-120mg/ml、50-100mg/ml、50-90mg/ml、60-80mg/ml或60-75mg/ml，诸如至少63mg/ml、或至少65mg/ml、或至少70mg/ml。
4、多孔载体的体积加权中值直径(d50v)可以是35-90μm、40-80μm、50-70μm、55-70μm、55-67μm、58-70μm或58-67μm，诸如至少60μm或至少62μm。
5、根据上文的分离基质可以具有通过反相尺寸排阻色谱使用mw110kda的葡聚糖作为探针分子测量的0.6-0.95的kd值，诸如0.7-0.9的kd值，或0.6-0.8的kd值，诸如约0.67的kd值，或约0.72的kd值，或约0.75的kd值。
6、根据上文的分离基质中的聚合物颗粒可以是交联的。
7、在根据上文的分离基质中，碱稳定的蛋白l结构域中的至少两个可以选自大芬戈尔德氏菌(先前称为大消化链球菌)蛋白l的b1结构域、b2结构域、b3结构域、b4结构域、b5结构域、c2结构域、c3结构域、c4结构域和d1结构域的功能变体，其中在比对中对应于b2结构域(seq id no 1)中的位置10和45的位置是组氨酸，并且在比对中对应于b2结构域(seq idno 1)中的位置60的位置是酪氨酸或谷氨酰胺。所述至少两个碱稳定的蛋白l结构域可以优选选自b2结构域、b3结构域、b4结构域、c2结构域、c3结构域、c4结构域和d1结构域。
8、所述至少两个碱稳定的蛋白l结构域与氨基酸序列seq id no 2、seq id no 3、seq id no 4、seq id no 5、seq id no 6、seq id no 7、seq id no 8、seq id no 9、seqid no 10、seq id no 11、seq id no 12、seq id no 13、seq id no 14、seq id no 15、seqid no 16、seq id no 17、seq id no 18或seq id no 19中的任一个可以具有至少90％、95％或98％的序列同一性或77.5％的序列相似性，如通过75的blosum矩阵所确定的，其中空位开放罚分为12、空位延伸罚分为3，其中在比对中对应于seq id no 1中的位置10和45的位置以及在比对中对应于seq id no 1中的位置60的位置是不可变的。
9、根据上文的分离基质可以包含三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个碱稳定的蛋白l结构域。根据上文的分离基质可以优选包含四个、五个或六个碱稳定的蛋白l结构域。
10、配体可以额外包含偶联元件，所述偶联元件是在配体的c-末端的一个或多个半胱氨酸残基、一个或多个赖氨酸残基或一个或多个组氨酸残基。优选地，配体在配体的c-末端包含一个或多个半胱氨酸残基。
11、优选地，根据上文的分离基质在4min停留时间对igg的10％穿透动态结合容量为至少55mg/ml。优选地，根据上文的分离基质在6min停留时间对igg的10％穿透动态结合容量为至少70mg/ml。优选地，根据上文的分离基质在10min停留时间对igg的10％穿透动态结合容量为至少80mg/ml。
12、优选地，根据上文的分离基质在22+/-2℃下在0.1m naoh中孵育24h后的igg容量为孵育前igg容量的至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％。优选地，根据上述任一项的分离基质在22+/-2℃下在0.3m naoh中孵育32h后的igg容量为孵育前igg容量的至少90％。优选地，根据上文的分离基质在22+/-2℃下在0.5mnaoh中孵育12h后的igg容量为孵育前igg容量的至少95％，或至少93％。
13、根据另一方面，本公开提供了一种分离含κ轻链的蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：
14、a)使包含含κ轻链的蛋白质的液体样品与分离基质接触，
15、b)用一种洗涤液或几种洗涤液的组合洗涤所述分离基质，
16、c)用洗脱液从所述分离基质上洗脱所述含κ轻链的蛋白质，和
17、d)用清洁液清洁所述分离基质，
18、其中所述分离基质在22+/-2℃下在0.1m naoh中孵育24h后的igg容量是孵育前igg容量的至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％。
19、根据又另一个方面，本公开提供了一种用于分离双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
20、a)使包含含κ轻链的蛋白质的液体样品与分离基质接触，
21、b)用一种洗涤液或几种洗涤液的组合洗涤所述分离基质，
22、c)用洗脱液和在降低ph下从所述分离基质上洗脱所述含κ轻链的蛋白质，
23、d)用清洁液清洁所述分离基质，
24、其中所述分离基质在22+/-2℃下在0.1m naoh中孵育24h后的igg容量是孵育前igg容量的至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％。
25、在上述方法的任一种中降低ph可以通过使用ph梯度来进行。可替代地，在上述方法的任一种中降低ph可以以逐步方式进行。在上述方法的任一种中，降低ph可以是约5.5至约2，诸如约5至约2，约4.5至约2，或约4至约2。
26、清洁液可以包含0.01-1.0m的naoh或koh，诸如0.05-1.0m或0.05-0.1m，或0.05-0.3m，或0.05-0.5naoh或koh。
27、洗脱液可以包含至少一种选自乙酸根、柠檬酸根、氨基乙酸根、琥珀酸根、磷酸根和甲酸根的阴离子物质。
28、在上述方法的任一种中的步骤a)-d)可以重复至少10次，诸如至少50次或50-200次。
29、在上述方法的任一种中使用的分离基质可以是根据第一方面的分离基质或如上所公开的其任何变体。
30、另外，在又另一个方面，本文提供了一种色谱柱，所述色谱柱包含根据第一方面的分离基质和如上所公开的其任何变体。
31、根据另一个方面，本文提供了根据上文的色谱柱在上文公开的方法中的任一种中的用途。
1.一种分离基质，所述分离基质包含至少12mg/ml共价偶联至多孔载体的κ轻链结合配体，其中
2.根据权利要求1所述的分离基质，其中所述基质包含至少14mg/mlκ轻链结合配体，诸如至少14.5mg/ml、至少15mg/ml、至少15.5mg/ml、至少16mg/ml、至少16.5mg/ml、至少17mg/ml、至少17.5mg/ml、至少18mg/ml、至少18.5mg/ml或至少19mg/mlκ轻链结合配体。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的分离基质，其中所述多孔载体的dw是50-150mg/ml、50-120mg/ml、50-100mg/ml、50-90mg/ml、60-80mg/ml或60-75mg/ml，诸如至少63mg/ml、或至少65mg/ml、或至少70mg/ml。
4.根据前述权利要求中任一项所述的分离基质，其中所述多孔载体的体积加权中值直径(d50v)是35-90μm、40-80μm、50-70μm、55-70μm、55-67μm、58-70μm或58-67μm，诸如至少60μm或至少62μm。
5.根据权利要求4所述的分离基质，所述分离基质具有通过反相尺寸排阻色谱使用mw110kda的葡聚糖作为探针分子测量的0.6-0.95的kd值，诸如0.7-0.9的kd值，或0.6-0.8的kd值，诸如约0.67的kd值，或约0.72的kd值，或约0.75的kd值。
6.根据前述权利要求中任一项所述的分离基质，其中所述聚合物颗粒是交联的。
7.根据前述权利要求中任一项所述的分离基质，其中所述碱稳定的蛋白l结构域中的至少两个选自大芬戈尔德氏菌(先前称为大消化链球菌)蛋白l的b1结构域、b2结构域、b3结构域、b4结构域、b5结构域、c2结构域、c3结构域、c4结构域和d1结构域的功能变体，其中在比对中对应于b2结构域(seq id no 1)中的位置10和45的位置是组氨酸，并且在比对中对应于b2结构域(seq id no 1)中的位置60的位置是酪氨酸或谷氨酰胺。
8.根据权利要求7所述的分离基质，其中所述至少两个碱稳定的蛋白l结构域选自b2结构域、b3结构域、b4结构域、c2结构域、c3结构域、c4结构域和d1结构域。
9.根据权利要求7或8所述的分离基质，其中所述至少两个碱稳定的蛋白l结构域与氨基酸序列seq id no 2、seq id no 3、seq id no 4、seq id no 5、seq id no 6、seq id no7、seq id no 8、seq id no 9、seq id no 10、seq id no 11、seq id no 12、seq id no13、seq id no 14、seq id no 15、seq id no 16、seq id no 17、seq id no 18或seq idno 19中的任一个具有至少90％、95％或98％的序列同一性或77.5％的序列相似性，如通过75的blosum矩阵所确定的，其中空位开放罚分为12、空位延伸罚分为3，其中在比对中对应于seq id no 1中的位置10和45的位置以及在比对中对应于seq id no 1中的位置60的位置是不可变的。
10.根据前述权利要求中任一项所述的分离基质，其中所述分离基质包含三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个碱稳定的蛋白l结构域。
11.根据权利要求10所述的分离基质，其中所述分离基质包含四个、五个或六个碱稳定的蛋白l结构域。
12.根据前述权利要求中任一项所述的分离基质，其中所述配体包含偶联元件，所述偶联元件是在所述配体的c-末端的一个或多个半胱氨酸残基、一个或多个赖氨酸残基、或一个或多个组氨酸残基。
13.根据权利要求12所述的分离基质，其中所述配体在所述配体的c-末端包含一个或多个半胱氨酸残基。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的分离基质，其中所述分离基质在4min停留时间对igg的10％穿透动态结合容量为至少55mg/ml。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的分离基质，其中所述分离基质在6min停留时间对igg的10％穿透动态结合容量为至少70mg/ml。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的分离基质，其中所述分离基质在10min停留时间对igg的10％穿透动态结合容量为至少80mg/ml。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的分离基质，其中所述分离基质在22+/-2℃下在0.1m naoh中孵育24h后的igg容量是所述孵育前igg容量的至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的分离基质，其中所述分离基质在22+/-2℃下在0.3m naoh中孵育32h后的igg容量是所述孵育前igg容量的至少90％。
19.根据权利要求1-16中任一项所述的分离基质，其中所述分离基质在22+/-2℃下在0.5m naoh中孵育12h后的igg容量是所述孵育前igg容量的至少95％，或至少93％。
20.一种分离含κ轻链的蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：
21.一种用于分离双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
22.根据权利要求21所述的方法，其中降低ph通过使用ph梯度进行。
23.根据权利要求21所述的方法，其中降低ph以逐步方式进行。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的方法，其中所述降低ph是约5.5至约2，诸如约5至约2，约4.5至约2，或约4至约2。
25.根据权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述清洁液包含0.01-1.0m naoh或koh，诸如0.05-1.0m或0.05-0.1m，或0.05-0.3m，或0.05-0.5naoh或koh。
26.根据权利要求20-25中任一项所述的方法，其中所述洗脱液包含至少一种选自乙酸根、柠檬酸根、氨基乙酸根、琥珀酸根、磷酸根和甲酸根的阴离子物质。
27.根据权利要求20-26中任一项所述的方法，其中步骤a)-d)重复至少10次，诸如至少50次或50-200次。
28.根据权利要求20-27中任一项所述的方法，其中所述分离基质是根据权利要求1-19中任一项所述的。
29.一种色谱柱，所述色谱柱包含根据权利要求1-19中任一项所述的分离基质。
30.根据权利要求29所述的色谱柱在根据权利要求20-28中任一项所述的方法中的用途。
