背景技术：
1、用分子条形码在分区中标记生物底物可以通过分子条形码的测序和其分析，为共定位到离散分区的底物提供新的生物学见解。增加如液滴等条形码编码有效分区的数量增加了基于测序的数据点的数量，并将较大部分的输入底物转换为数据。可以使用珠粒作为递送媒剂将条形码递送到如液滴等分区。为了唯一地鉴定每个分区，可以用独特条形码序列的克隆拷贝来标记珠粒，这些克隆拷贝可以释放到分区中，从而以分区特异性方式标记分区中的分子。
技术实现思路
1、在一些实施例中，提供了一种从珠粒中释放寡核苷酸的方法。在一些实施例中，所述方法包括：
2、(i)提供反应混合物，所述反应混合物包括：
3、多个珠粒，每个珠粒与包括第一端序列的第一寡核苷酸共价连接；
4、第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括第二端序列；以及
5、连接寡核苷酸，所述连接寡核苷酸包括：(i)与所述第一端序列反向互补的第一末端序列；以及(ii)与所述第二端序列反向互补的第二末端序列，
6、其中所述第一末端序列和所述第一端序列杂交并且具有第一熔融温度(tm)，并且(ii)所述第二末端序列和所述第二端序列杂交并且具有第二tm，使得所述连接寡核苷酸将所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸连接；
7、(ii)将所述反应混合物的温度升高至高于所述第一tm和所述第二tm中的至少一者，使得所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸与所述连接寡核苷酸的至少一端解离；
8、(iii)将所述反应混合物的温度降低至低于所述第一tm和所述第二tm，
9、其中在所述升高之后并且在所述降低之前，所述反应混合物进一步包括阻断寡核苷酸，所述阻断寡核苷酸包括：
10、(a)与所述第一端序列反向互补但不包括与所述第二端序列反向互补的多于3个连续核苷酸的序列，使得所述阻断寡核苷酸与所述连接寡核苷酸竞争与所述第一寡核苷酸杂交，从而允许所述第二寡核苷酸保持从所述珠粒释放的序列；或
11、(b)与所述第二端序列反向互补但不包括与所述第一端序列反向互补的多于3个连续核苷酸的序列，使得所述阻断寡核苷酸与所述连接寡核苷酸竞争与所述第二寡核苷酸杂交，从而允许所述第二寡核苷酸保持从所述珠粒释放的序列；或
12、(c)作为所述第一端序列但不包括所述第二端序列中的多于3个连续核苷酸的序列，使得所述阻断寡核苷酸与所述连接寡核苷酸竞争与所述第一寡核苷酸杂交，从而允许所述第二寡核苷酸保持从所述珠粒释放的序列；或
13、(d)作为所述第二端序列但不包括作为所述第一端序列的多于3个连续核苷酸的序列，使得所述阻断寡核苷酸与所述连接寡核苷酸竞争与所述第二寡核苷酸杂交，从而允许所述第二寡核苷酸保持从所述珠粒释放的序列。
14、在一些实施例中，所述第一端序列是3'端序列。在一些实施例中，所述第一端序列是5'端序列。
15、在一些实施例中，所述第二寡核苷酸具有条形码序列，其中单独的珠粒包括所述第二寡核苷酸的克隆拷贝，并且其中单独的珠粒的所述条形码序列是唯一的，使得条形码将所述珠粒与所述多个珠粒中的其它珠粒区分开。在一些实施例中，所述第二寡核苷酸的3'端包括靶特异性序列。在一些实施例中，所述第二寡核苷酸的3'端包括通用标签序列。在一些实施例中，所述第二寡核苷酸的3'端包括至少4个连续胸腺嘧啶。
16、在一些实施例中，所述提供(i)包括形成珠粒的混合物，其中每个珠粒与包括所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸的长寡核苷酸共价连接，其中所述第一寡核苷酸的所述第一端序列与所述第二寡核苷酸的所述第二端序列直接连接或通过接头序列间接连接，并且其中不同珠粒上的长寡核苷酸能通过所述长寡核苷酸中的不同条形码序列区分；以及使所述连接寡核苷酸与所述长寡核苷酸杂交，使得所述第一末端序列与所述第一端序列杂交，并且所述第二末端序列与所述第二端序列杂交；以及切割位于所述第一端序列与所述第二端序列之间的所述长寡核苷酸，同时所述连接寡核苷酸保持完整，并且将所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸连接。在一些实施例中，所述接头序列包括一个或多个尿嘧啶核苷酸，并且所述切割包括使所述长寡核苷酸与尿嘧啶dna糖基化酶和核酸内切酶viii接触，由此切除一个或多个尿嘧啶。在一些实施例中，所述接头序列包括一个或多个核糖核苷酸，并且所述切割包括使用rnaseh以核糖核苷酸特异性方式切割接头序列。在一些实施例中，限制位点定位在所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸之间，并且所述切割包括使所述长寡核苷酸与限制酶接触，所述限制酶切割所述长寡核苷酸上的所述限制位点，而不使用切口核酸内切酶切割所述连接寡核苷酸。
17、在一些实施例中，在所述切割位于所述第一端序列与所述第二端序列之间的所述长寡核苷酸之后，将所述阻断寡核苷酸添加到所述反应混合物中。
18、在一些实施例中，所述反应混合物中的所述阻断寡核苷酸的浓度高于所述反应混合物中的接头寡核苷酸的浓度。在一些实施例中，所述阻断寡核苷酸对所述第一序列的亲和力(kd)低于所述接头寡核苷酸对所述第一序列的亲和力。
19、在一些实施例中，所述方法进一步包括在所述提供(i)之后并且在所述升高(ii)之前，将所述反应混合物分配到多个分区中，其中所述多个珠粒中的不同珠粒被递送到不同分区中。在一些实施例中，所述分区是微孔、纳米孔或液滴。
20、在一些实施例中，所述方法进一步包括在所述提供(i)之后并且在所述升高(ii)之前，将所述反应混合物分配到2d阵列上，其中所述多个珠粒中的不同珠粒被递送到所述2d阵列上的不同位置上。
21、在一些实施例中，提供了一种形成与珠粒连接的经切割的寡核苷酸的方法。在一些实施例中，所述方法包括：形成珠粒的混合物，其中每个珠粒与包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的长寡核苷酸共价连接，其中所述第一寡核苷酸的第一端序列与所述第二寡核苷酸的第二端序列直接连接或通过接头序列间接连接，并且其中不同珠粒上的长寡核苷酸能通过所述长寡核苷酸中的不同条形码序列区分；以及使连接寡核苷酸与所述长寡核苷酸杂交，其中所述连接寡核苷酸包括：(i)与所述第一端序列反向互补的第一末端序列；以及(ii)与所述第二端序列反向互补的第二末端序列，其中所述杂交使得所述第一末端序列与所述第一端序列杂交，并且所述第二末端序列与所述第二端序列杂交；以及切割位于所述第一端序列与所述第二端序列之间的所述长寡核苷酸，同时所述连接寡核苷酸保持完整，并且将所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸连接。
22、在一些实施例中，接头序列包括一个或多个尿嘧啶核苷酸，并且所述切割包括使所述长寡核苷酸与尿嘧啶dna糖基化酶和核酸内切酶viii接触，由此切除一个或多个尿嘧啶。在一些实施例中，所述接头序列包括一个或多个核糖核苷酸，并且所述切割包括使用rnaseh以核糖核苷酸特异性方式切割接头序列。在一些实施例中，限制位点定位在所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸之间，并且所述切割包括使所述长寡核苷酸与限制酶接触，所述限制酶切割所述长寡核苷酸上的所述限制位点，而不使用切口核酸内切酶切割所述连接寡核苷酸。
23、在一些实施例中，在所述切割位于所述第一端序列与所述第二端序列之间的所述长寡核苷酸之后，将阻断寡核苷酸添加到所述反应混合物中。
24、还提供了一种反应混合物，其包括例如：多个珠粒，每个珠粒与包括第一端序列的第一寡核苷酸共价连接；第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括第二端序列；以及连接寡核苷酸，所述连接寡核苷酸包括：(i)与所述第一端序列反向互补的第一末端序列；以及(ii)与所述第二端序列反向互补的第二末端序列；以及阻断寡核苷酸，所述阻断寡核苷酸包括：
25、(a)与所述第一端序列反向互补但不包括与所述第二端序列反向互补的多于3个连续核苷酸的序列，使得所述阻断寡核苷酸与所述连接寡核苷酸竞争与所述第一寡核苷酸杂交，从而允许所述第二寡核苷酸保持从所述珠粒释放的序列；或
26、(b)与所述第二端序列反向互补但不包括与所述第一端序列反向互补的多于3个连续核苷酸的序列，使得所述阻断寡核苷酸与所述连接寡核苷酸竞争与所述第二寡核苷酸杂交，从而允许所述第二寡核苷酸保持从所述珠粒释放的序列；或
27、(c)作为所述第一端序列但不包括所述第二端序列中的多于3个连续核苷酸的序列，使得所述阻断寡核苷酸与所述连接寡核苷酸竞争与所述第一寡核苷酸杂交，从而允许所述第二寡核苷酸保持从所述珠粒释放的序列；或
28、(d)作为所述第二端序列但不包括作为所述第一端序列的多于3个连续核苷酸的序列，使得所述阻断寡核苷酸与所述连接寡核苷酸竞争与所述第二寡核苷酸杂交，从而允许所述第二寡核苷酸保持从所述珠粒释放的序列。
29、在一些实施例中，所述第一端序列是3'端序列。在一些实施例中，所述第一端序列是5'端序列。
30、在一些实施例中，所述第二寡核苷酸具有条形码序列，其中单独的珠粒包括所述第二寡核苷酸的克隆拷贝，并且其中单独的珠粒的所述条形码序列是唯一的，使得条形码将所述珠粒与所述多个珠粒中的其它珠粒区分开。在一些实施例中，所述第二寡核苷酸的3'端包括靶特异性序列。在一些实施例中，所述第二寡核苷酸的3'端包括通用标签序列。在一些实施例中，所述第二寡核苷酸的3'端包括至少4个连续胸腺嘧啶。
31、在一些实施例中，接头序列包括一个或多个尿嘧啶核苷酸。在一些实施例中，接头序列包括一个或多个核糖核苷酸。在一些实施例中，限制位点定位在所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸之间。
32、还提供了一种试剂盒(例如，容器，任选地带有说明书)，其包括如上文或本文其它地方所描述的多个珠粒。
33、还提供了一种反应混合物，其包括：多个珠粒，每个珠粒与包括第一端序列的第一寡核苷酸共价连接；第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括第二端序列；以及连接寡核苷酸，所述连接寡核苷酸包括：(i)与所述第一端序列反向互补的第一末端序列；以及(ii)与所述第二端序列反向互补的第二末端序列，其中所述第一末端序列和所述第一端序列杂交并且具有第一熔融温度(tm)，并且(ii)所述第二末端序列和所述第一端序列杂交并且具有第二tm，使得所述连接寡核苷酸将所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸连接；其中所述反应混合物任选地包括阻断寡核苷酸，所述阻断寡核苷酸包括：
34、(a)与所述第一端序列反向互补但不包括与所述第二端序列反向互补的多于3个连续核苷酸的序列，使得所述阻断寡核苷酸与所述连接寡核苷酸竞争与所述第一寡核苷酸杂交，从而允许所述第二寡核苷酸保持从所述珠粒释放的序列；或
35、(b)与所述第二端序列反向互补但不包括与所述第一端序列反向互补的多于3个连续核苷酸的序列，使得所述阻断寡核苷酸与所述连接寡核苷酸竞争与所述第二寡核苷酸杂交，从而允许所述第二寡核苷酸保持从所述珠粒释放的序列；或
36、(c)作为所述第一端序列但不包括所述第二端序列中的多于3个连续核苷酸的序列，使得所述阻断寡核苷酸与所述连接寡核苷酸竞争与所述第一寡核苷酸杂交，从而允许所述第二寡核苷酸保持从所述珠粒释放的序列；或
37、(d)作为所述第二端序列但不包括作为所述第一端序列的多于3个连续核苷酸的序列，使得所述阻断寡核苷酸与所述连接寡核苷酸竞争与所述第二寡核苷酸杂交，从而允许所述第二寡核苷酸保持从所述珠粒释放的序列。
38、在一些实施例中，所述第一端序列是3'端序列。在一些实施例中，所述第一端序列是5'端序列。
39、在一些实施例中，所述第二寡核苷酸具有条形码序列，其中单独的珠粒包括所述第二寡核苷酸的克隆拷贝，并且其中单独的珠粒的所述条形码序列是唯一的，使得条形码将所述珠粒与所述多个珠粒中的其它珠粒区分开。在一些实施例中，所述第二寡核苷酸的3'端包括靶特异性序列。在一些实施例中，所述第二寡核苷酸的3'端包括通用标签序列。在一些实施例中，所述第二寡核苷酸的3'端包括至少4个连续胸腺嘧啶。
40、还提供了一种试剂盒，其包括如上文所描述的多个珠粒。
41、还提供了一种混合物，其包括多个珠粒，其中每个珠粒与发夹寡核苷酸共价连接，所述发夹寡核苷酸从5'至3'包括第一序列的反向补体、环序列、所述第一序列的第一拷贝以及第二序列，其中所述第一序列的所述反向补体与所述第一序列的所述第一拷贝杂交，并且所述第二序列位于所述发夹寡核苷酸的3'端处，其中可切割序列定位在所述第一序列的所述反向补体中、定位在所述环序列中或定位在所述第一序列的所述第一拷贝中，其中所述第一序列具有条形码序列，其中单独的珠粒包括所述第一序列的克隆拷贝，并且其中单独的珠粒的所述条形码序列是唯一的，使得条形码将所述珠粒与所述多个珠粒中的其它珠粒区分开。
42、在一些实施例中，所述环序列进一步包括定位在所述可切割序列的5'处的所述第一序列的第二拷贝。在一些实施例中，所述第二寡核苷酸的3'端包括靶特异性序列。在一些实施例中，所述第二寡核苷酸的3'端包括通用标签序列。在一些实施例中，所述第二寡核苷酸的3'端包括至少4个连续胸腺嘧啶。
43、在一些实施例中，所述可切割序列包括一个或多个尿嘧啶核苷酸。在一些实施例中，所述可切割序列包括一个或多个核糖核苷酸。在一些实施例中，所述可切割序列包括限制位点。
44、还提供了一种试剂盒，其包括如上文所描述的多个珠粒。
45、还提供了一种形成多个经释放的寡核苷酸的方法。在一些实施例中，所述方法包括：提供如上文或本文其它地方所描述的混合物；以及切割位于所述第一序列的所述第二拷贝的3'处的所述可切割序列，而所述第一序列的所述第一拷贝和所述第一序列的所述反向补体保持杂交，从而通过所述杂交将所述第一序列的所述第一拷贝与所述珠粒连接。
46、在一些实施例中，所述可切割序列包括一个或多个尿嘧啶核苷酸，并且所述切割包括使所述长寡核苷酸与尿嘧啶dna糖基化酶和核酸内切酶viii接触，由此切除一个或多个尿嘧啶。在一些实施例中，所述可切割序列包括一个或多个核糖核苷酸，并且所述切割包括使用rnaseh以核糖核苷酸特异性方式切割接头序列。在一些实施例中，所述可切割序列包括限制位点，并且所述切割包括使切口核酸内切酶与所述可切割序列接触。
47、在一些实施例中，所述方法进一步包括将反应混合物分配到多个分区中，其中所述多个珠粒中的不同珠粒被递送到不同分区中。在一些实施例中，所述分区是微孔、纳米孔或液滴。在一些实施例中，所述方法进一步包括在所述提供(i)之后并且在所述升高(ii)之前，将所述反应混合物分配到2d阵列上，其中所述多个珠粒中的不同珠粒被递送到所述2d阵列上的不同位置上。
48、在一些实施例中，所述环序列进一步包括定位在所述可切割序列的5'处的所述第一序列的第二拷贝，并且其中所述第一序列的所述第一拷贝和所述第一序列的所述反向补体在杂交时具有熔融温度(tm)，并且所述方法进一步包括在所述分配之后，(ii)将所述反应混合物的温度升高至高于所述tm，使得所述第一序列的所述第一拷贝与所述第一序列的所述反向补体解离；(iii)将所述反应混合物的温度降低至低于所述tm，其中所述第一序列的所述第二拷贝与所述第一序列的所述第一拷贝竞争与所述第一序列的所述反向补体杂交，从而允许包括所述第一序列的所述第一拷贝和所述第二序列的寡核苷酸在所述降低之后保持从所述珠粒释放。
49、在一些实施例中，所述第一序列的所述第一拷贝和所述第一序列的所述反向补体在杂交时具有熔融温度(tm)，并且所述方法进一步包括在所述分配之后，(ii)将所述反应混合物的温度升高至高于所述tm，使得所述第一序列的所述第一拷贝与所述第一序列的所述反向补体解离；(iii)将所述反应混合物的温度降低至低于所述tm，其中在所述升高之后并且在所述降低之前，所述混合物进一步包括阻断寡核苷酸，所述阻断寡核苷酸包括所述第一序列的第二拷贝，使得所述阻断寡核苷酸与所述第一序列的所述第一拷贝竞争与所述第一寡核苷酸杂交，从而允许包括所述第一序列的所述第一拷贝和所述第二序列的寡核苷酸在所述降低之后保持从所述珠粒释放。
50、定义
51、除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语的含义总体上与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。通常，本文所使用的命名法以及下文所描述的细胞培养、分子遗传学、有机化学以及核酸化学与杂交中的实验室程序是本领域中众所周知并且通常采用的那些。标准技术用于核酸和肽合成。技术和程序通常根据本领域的常规方法和各种一般参考文献来执行(通常参见，sambrook等人《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:alaboratory manual)》,第2版(1989)纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.)，所述文献通过引用并入本文)，所述常规方法和各种一般参考文献在本文档中通篇提供。本文所用的命名法以及下文所述的分析化学和有机合成中的实验室程序是本领域众所周知和常用的。
52、术语“扩增反应”是指以线性或指数方式扩增核酸的靶序列的拷贝的任何体外手段。此类方法包含但不限于：两引物方法，如聚合酶链式反应(pcr)；连接酶方法，如dna连接酶链式反应(参见美国专利第4,683,195号和第4,683,202号；《pcr方案：方法和应用指南(pcr protocols:aguide to methods and applications)》(innis等人编辑,1990))(lcr)；qbeta rna复制酶和基于rna转录的扩增反应(例如，涉及t7、t3或sp6引发的rna聚合的扩增)，如转录扩增系统(tas)、基于核酸序列的扩增(nasba)和自持序列复制(3sr)；等温扩增反应(例如，单引物等温扩增(spia))；以及本领域技术人员已知的其它技术。
53、“扩增”是指如果反应的所有组分都完好无损，将溶液置于足以扩增多核苷酸的条件下的步骤。扩增反应的组分包含例如，引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。术语“扩增”通常指靶核酸的“指数”增加。然而，如本文所使用的，“扩增”也可以指核酸的选定靶序列的数量的线性增加，如通过循环测序或线性扩增获得的。在示例性实施例中，扩增是指使用第一扩增引物和第二扩增引物的pcr扩增。
54、“引物”是指与靶核酸上的序列杂交并作为核酸合成的起始点的多核苷酸序列。引物可以具有各种长度，并且长度通常小于50个核苷酸，例如长度为12至30个核苷酸。用于pcr的引物的长度和序列可以基于本领域技术人员已知的原理来设计，参见例如，innis等人,同上。引物可以是dna、rna或dna和rna部分的嵌合体。在一些情况下，引物可以包含一个或多个经修饰的或非天然的核苷酸碱基。在一些情况下，引物被标记。
55、核酸或其一部分在一定条件下与另一种核酸“杂交”，使得在限定温度下生理缓冲液(例如，ph 6-9，25-150mm氯化物盐)中的非特异性杂交最小。在一些情况下，核酸或其部分与一组靶核酸中共有的保守序列杂交。在一些情况下，如果存在至少约6、8、10、12、14、16或18个连续互补核苷酸，包含与多于一个核苷酸配偶体互补的“通用”核苷酸，则引物或其部分可以与引物结合位点杂交。可替代地，如果在至少约12、14、16、18或20个连续核苷酸上存在0个或少于2个或3个互补错配，则引物或其部分可以与引物结合位点杂交。在一些实施例中，发生特异性杂交的限定温度为室温。在一些实施例中，发生特异性杂交的定义的温度高于室温。在一些实施例中，发生特异性杂交的限定温度为至少约37、40、42、45、50、55、60、65、70、75或80℃。在一些实施例中，发生特异性杂交的限定温度为37、40、42、45、50、55、60、65、70、75或80℃。
56、“模板”是指包括要扩增的多核苷酸、邻近引物杂交位点或侧接一对引物杂交位点的多核苷酸序列。因此，“靶模板”包括与引物的至少一个杂交位点相邻的靶多核苷酸序列。在一些情况下，“靶模板”包括靶多核苷酸序列，所述靶多核苷酸序列侧接“正向”引物和“反向”引物的杂交位点。
57、如本文所使用的，“核酸”意指dna、rna、单链、双链或更高度聚集的杂交基序以及其任何化学修饰。修饰包含但不限于提供化学基团的修饰，所述化学基团并入另外的电荷、极化性、氢键合、静电相互作用、附接点和对于核酸配体碱基或对于整个核酸配体的功能性。此类修饰包含但不限于肽核酸(pna)、磷酸二酯基团修饰(例如，硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、2'-位置糖修饰、5-位置嘧啶修饰、8-位置嘌呤修饰、外环胺处的修饰、4-硫尿苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代；主链修饰、甲基化、不寻常的碱基配对组合，如异碱基、异胞苷和异胍等。核酸还可以包含非天然碱基，例如硝基吲哚。修饰也可以包含3'和5'修饰，所述修饰包含但不限于用荧光团(例如，量子点)或另一部分封端。
58、“聚合酶”是指进行模板导向的多核苷酸(例如，dna和/或rna)的合成的酶。所述术语涵盖全长多肽和具有聚合酶活性的结构域两者。dna聚合酶是本领域技术人员众所周知的，包含但不限于分离或源自强烈火球菌(pyrococcus furiosus)、嗜热高温球菌(thermococcus litoralis)和海栖热袍菌(thermotoga maritime)的dna聚合酶或其经修饰的版本。可商购获得的聚合酶的另外的实例包含但不限于：klenow片段(new england股份有限公司)、taq dna聚合酶(凯杰公司(qiagen))、9°ntmdna聚合酶(newengland股份有限公司)，deep venttmdna聚合酶(new england股份有限公司)、manta dna聚合酶bst dna聚合酶(new england股份有限公司)和phi29dna聚合酶(new england股份有限公司)。
59、聚合酶包含dna依赖性聚合酶和rna依赖性聚合酶两者，如逆转录酶。已知至少有五个dna依赖性dna聚合酶家族，尽管大多数属于a、b和c家族。其它类型的dna聚合酶包含噬菌体聚合酶。类似地，rna聚合酶通常包含真核rna聚合酶i、ii和iii，以及细菌rna聚合酶以及噬菌体和病毒聚合酶。rna聚合酶可以是dna依赖性的和rna依赖性的。
60、如本文所使用的，术语“分区”或“分区的”是指将样品分离为多个部分或“分区”。分区通常是物理的，因此一个分区中的样品不会或基本上不会与邻近分区中的样品混合。分区可以是固体的或流体的。在一些实施例中，分区是固体分区，例如，微通道或微孔。在一些实施例中，分区是流体分区，例如，液滴。在一些实施例中，流体分区(例如，液滴)是不混溶流体(例如，水和油)的混合物。在一些实施例中，流体分区(例如，液滴)是被不混溶载体流体(例如，油)包围的水性液滴。孔的示例性阵列和孔描述可见于例如美国专利第9,103,754号和第10,391,493号中。孔的阵列(一组纳米孔、微孔、孔)可以用于捕获固相载体，任选地在可寻址的已知位置。因此，孔的阵列可以被配置成促进单固相载体形式或任选地固相载体的小组中的至少一种固相载体中的珠粒捕获。示例性微孔阵列和将珠粒递送到微孔的方法及其分析描述于例如pct/us2021/034152中。
61、如本文所使用的，“条形码”是鉴定其所缀合或其所源自的分区的分子的短核苷酸序列(例如，至少约4、6、8、10、12、15、20、50或75或100个核苷酸长或更长)。条形码可以用于例如鉴定源自分区、珠粒或斑点的分子，如稍后从本体反应测序的。与其它分区、珠粒或斑点中存在的条形码相比，这种条形码对于所述分区、珠粒或斑点可能是唯一的。例如，含有来自单细胞的靶rna的分区可以使用在每个分区中含有不同分区特异性条形码序列的引物经受逆转录条件，从而将唯一的“细胞条形码”(因为不同的细胞处于不同的分区中，并且每个分区都有唯一的分区特异性条形码)的拷贝并入每个分区的经逆转录的核酸中。因此，由于唯一的“细胞条形码”，可以将来自每个细胞的核酸与来自其它细胞的核酸区分开。在本文所描述的一些实施例中，本文所描述的条形码唯一地鉴定与其缀合的分子，即，条形码充当唯一分子标识符(umi)。可能的条形码序列的长度确定可以区分多少独特样品。例如，取决于简并，1个核苷酸条形码可以区分4个或更少的不同分区；4个核苷酸条形码可以区分44或256个分区或更少；6个核苷酸条形码可以区分4096个不同分区或更少；并且8个核苷酸条形码可以索引65,536个不同分区或更少。
62、如本文所用的，术语“一个/一种(a/an)”或“所述(the)”不仅包含具有一个成员的方面，而且还包含具有多于一个成员的方面。例如，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包含复数指示物。因此，例如，提及“珠粒”包含多个此类珠粒，并且提及“所述序列”包含提及本领域技术人员已知的一种或多种序列等。
63、“寡核苷酸”是多核苷酸。通常，寡核苷酸将具有少于250个核苷酸，在一些实施例中，4-200个，例如10-150个核苷酸。
64、多核苷酸的“克隆”拷贝意指拷贝在序列上是相同的。在一些实施例中，寡核苷酸的至少100、1000、104个或更多个克隆拷贝与珠粒连接。
65、“阵列”是有序的多个项目。所述术语可以指有序的多个寡核苷酸，或与任选地是平面的固体表面连接的有序阵列。“有序”是指阵列上的已知位置，并且不旨在指示项目的特定对准，但在一些实施例中，项目可以在网格中。
66、寡核苷酸上的“3'捕获序列”是指寡核苷酸的3'最多部分。捕获序列的长度可以为少至1-2个核苷酸，但更通常地长度为6-12个核苷酸，并且在一些实施例中长度为4-20个或更多个核苷酸。捕获序列可以与靶核酸(例如，靶核酸的3'端)完全互补，但如在一些实施例中以及某些条件下如所了解的，1、2、3、4个或更多个核苷酸可以错配，同时仍允许寡核苷酸的3'捕获序列粘接到靶核酸。在其它实施例中，可以选择条件，使得仅完全互补的序列将粘接。3'捕获序列可以是随机序列、poly t或poly a序列、靶特异性序列或通用序列。例如，在其中转座子(例如，经修饰的tn5，如tagmentase)插入端序列以对核酸进行采样的实施例中，捕获3'端序列可以与所添加的端序列互补。
67、对核酸进行“标记”是指将核酸与另一种标记多核苷酸，例如包括一个或多个条形码序列的标记多核苷酸连接。标记可以是共价的(例如，通过连接或通过引物延伸)或非共价的(仅通过沃森-克里克碱基配对(watson-crick base pairing))。
68、术语“珠粒”是指可以处于分区中的任何固相载体，例如小颗粒或其它固相载体。示例性珠粒可以包含水凝胶珠粒。在一些情况下，所述水凝胶呈溶胶形式。在一些情况下，所述水凝胶呈凝胶形式。示例性水凝胶是琼脂糖水凝胶。其它水凝胶包含但不限于在例如，美国专利第4,438,258号；第6,534,083号；第8,008,476号；第8,329,763号；美国专利申请第2002/0,009,591号；第2013/0,022,569号；第2013/0,034,592号；以及国际专利公开第wo/1997/030092号；以及第wo/2001/049240号中描述的水凝胶。
69、如本文所使用的，发夹寡核苷酸中的环序列是指寡核苷酸中不与寡核苷酸中的其它序列反向互补并且位于两个反向互补部分之间的部分。参见例如图4a中右侧所描绘的poly t部分。
1.一种从珠粒中释放寡核苷酸的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一端序列是3'端序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一端序列是5'端序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二寡核苷酸具有条形码序列，其中单独的珠粒包括所述第二寡核苷酸的克隆拷贝，并且其中单独的珠粒的所述条形码序列是唯一的，使得条形码将所述珠粒与所述多个珠粒中的其它珠粒区分开。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第二寡核苷酸的3'端包括靶特异性序列。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述第二寡核苷酸的3'端包括通用标签序列。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述第二寡核苷酸的3'端包括至少4个连续胸腺嘧啶。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述提供(i)包括形成珠粒的混合物，其中每个珠粒与包括所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸的长寡核苷酸共价连接，其中所述第一寡核苷酸的所述第一端序列与所述第二寡核苷酸的所述第二端序列直接连接或通过接头序列间接连接，并且其中不同珠粒上的长寡核苷酸能通过所述长寡核苷酸中的不同条形码序列区分；以及
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述接头序列包括一个或多个尿嘧啶核苷酸，并且所述切割包括使所述长寡核苷酸与尿嘧啶dna糖基化酶和核酸内切酶viii接触，由此切除一个或多个尿嘧啶。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述接头序列包括一个或多个核糖核苷酸，并且所述切割包括使用rnaseh以核糖核苷酸特异性方式切割接头序列。
11.根据权利要求8所述的方法，其中限制位点定位在所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸之间，并且所述切割包括使所述长寡核苷酸与限制酶接触，所述限制酶切割所述长寡核苷酸上的所述限制位点，而不使用切口核酸内切酶切割所述连接寡核苷酸。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中在所述切割位于所述第一端序列与所述第二端序列之间的所述长寡核苷酸之后，将所述阻断寡核苷酸添加到所述反应混合物中。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述反应混合物中的所述阻断寡核苷酸的浓度高于所述反应混合物中的接头寡核苷酸的浓度。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述阻断寡核苷酸对所述第一序列的亲和力(kd)低于所述接头寡核苷酸对所述第一序列的亲和力。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其进一步包括在所述提供(i)之后并且在所述升高(ii)之前，将所述反应混合物分配到多个分区中，其中所述多个珠粒中的不同珠粒被递送到不同分区中。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述分区是微孔、纳米孔或液滴。
17.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其进一步包括在所述提供(i)之后并且在所述升高(ii)之前，将所述反应混合物分配到2d阵列上，其中所述多个珠粒中的不同珠粒被递送到所述2d阵列上的不同位置上。
18.一种形成与珠粒连接的经切割的寡核苷酸的方法，所述方法包括
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述接头序列包括一个或多个尿嘧啶核苷酸，并且所述切割包括使所述长寡核苷酸与尿嘧啶dna糖基化酶和核酸内切酶viii接触，由此切除一个或多个尿嘧啶。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述接头序列包括一个或多个核糖核苷酸，并且所述切割包括使用rnaseh以核糖核苷酸特异性方式切割接头序列。
21.根据权利要求18所述的方法，其中限制位点定位在所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸之间，并且所述切割包括使所述长寡核苷酸与限制酶接触，所述限制酶切割所述长寡核苷酸上的所述限制位点，而不使用切口核酸内切酶切割所述连接寡核苷酸。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的方法，其中在所述切割位于所述第一端序列与所述第二端序列之间的所述长寡核苷酸之后，将阻断寡核苷酸添加到所述反应混合物中。
23.一种反应混合物，其包括：
24.根据权利要求23所述的反应混合物，其中所述第一端序列是3'端序列。
25.根据权利要求23所述的反应混合物，其中所述第一端序列是5'端序列。
26.根据权利要求23所述的反应混合物，其中所述第二寡核苷酸具有条形码序列，其中单独的珠粒包括所述第二寡核苷酸的克隆拷贝，并且其中单独的珠粒的所述条形码序列是唯一的，使得条形码将所述珠粒与所述多个珠粒中的其它珠粒区分开。
27.根据权利要求26所述的反应混合物，其中所述第二寡核苷酸的3'端包括靶特异性序列。
28.根据权利要求26所述的反应混合物，其中所述第二寡核苷酸的3'端包括通用标签序列。
29.根据权利要求26所述的反应混合物，其中所述第二寡核苷酸的3'端包括至少4个连续胸腺嘧啶。
30.根据权利要求23所述的反应混合物，其中接头序列包括一个或多个尿嘧啶核苷酸。
31.根据权利要求23所述的反应混合物，其中接头序列包括一个或多个核糖核苷酸。
32.根据权利要求23所述的反应混合物，其中限制位点定位在所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸之间。
33.一种试剂盒，其包括权利要求23至32中任一项的所述多个珠粒。
34.一种反应混合物，其包括：
35.根据权利要求34所述的反应混合物，其中所述第一端序列是3'端序列。
36.根据权利要求34所述的反应混合物，其中所述第一端序列是5'端序列。
37.根据权利要求34所述的反应混合物，其中所述第二寡核苷酸具有条形码序列，其中单独的珠粒包括所述第二寡核苷酸的克隆拷贝，并且其中单独的珠粒的所述条形码序列是唯一的，使得条形码将所述珠粒与所述多个珠粒中的其它珠粒区分开。
38.根据权利要求37所述的反应混合物，其中所述第二寡核苷酸的3'端包括靶特异性序列。
39.根据权利要求37所述的反应混合物，其中所述第二寡核苷酸的3'端包括通用标签序列。
40.根据权利要求37所述的反应混合物，其中所述第二寡核苷酸的3'端包括至少4个连续胸腺嘧啶。
41.一种试剂盒，其包括权利要求34至40中任一项的所述多个珠粒。
42.一种混合物，其包括多个珠粒，其中每个珠粒与发夹寡核苷酸共价连接，所述发夹寡核苷酸从5'至3'包括第一序列的反向补体、环序列、所述第一序列的第一拷贝以及第二序列，其中所述第一序列的所述反向补体与所述第一序列的所述第一拷贝杂交，并且所述第二序列位于所述发夹寡核苷酸的3'端处，
43.根据权利要求42所述的混合物，其中所述环序列进一步包括定位在所述可切割序列的5'处的所述第一序列的第二拷贝。
44.根据权利要求42或43所述的混合物，其中所述第二寡核苷酸的3'端包括靶特异性序列。
45.根据权利要求42或43所述的混合物，其中所述第二寡核苷酸的3'端包括通用标签序列。
46.根据权利要求42或43所述的混合物，其中所述第二寡核苷酸的3'端包括至少4个连续胸腺嘧啶。
47.根据权利要求42至46中任一项所述的混合物，其中所述可切割序列包括一个或多个尿嘧啶核苷酸。
48.根据权利要求42至46中任一项所述的混合物，其中所述可切割序列包括一个或多个核糖核苷酸。
49.根据权利要求42至46中任一项所述的混合物，其中所述可切割序列包括限制位点。
50.一种试剂盒，其包括权利要求42至49中任一项的所述多个珠粒。
51.一种形成多个经释放的寡核苷酸的方法，所述方法包括：
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述可切割序列包括一个或多个尿嘧啶核苷酸，并且所述切割包括使所述长寡核苷酸与尿嘧啶dna糖基化酶和核酸内切酶viii接触，由此切除一个或多个尿嘧啶。
53.根据权利要求42至46中任一项所述的方法，其中所述可切割序列包括一个或多个核糖核苷酸，并且所述切割包括使用rnaseh以核糖核苷酸特异性方式切割接头序列。
54.根据权利要求42至46中任一项所述的方法，其中所述可切割序列包括限制位点，并且所述切割包括使切口核酸内切酶与所述可切割序列接触。
55.根据权利要求51所述的方法，其进一步包括将反应混合物分配到多个分区中，其中所述多个珠粒中的不同珠粒被递送到不同分区中。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述分区是微孔、纳米孔或液滴。
57.根据权利要求55所述的方法，其进一步包括在所述提供(i)之后并且在所述升高(ii)之前，将所述反应混合物分配到2d阵列上，其中所述多个珠粒中的不同珠粒被递送到所述2d阵列上的不同位置上。
58.根据权利要求51至57中任一项所述的方法，其中所述环序列进一步包括定位在所述可切割序列的5'处的所述第一序列的第二拷贝，并且其中所述第一序列的所述第一拷贝和所述第一序列的所述反向补体在杂交时具有熔融温度(tm)，并且所述方法进一步包括在所述分配之后，
59.根据权利要求51至57中任一项所述的方法，其中所述第一序列的所述第一拷贝和所述第一序列的所述反向补体在杂交时具有熔融温度(tm)，并且所述方法进一步包括在所述分配之后，
