本技术涉及用于鉴定、表征和去除宿主细胞蛋白的方法。
背景技术：
1、生物治疗产品中的高分子量(hmw)聚集体在药物开发、商业制造以及产品在整个储存期限内的产品稳定性方面带来了挑战。hmw聚集体可能在制造、调配和装运或递送给患者期间形成。生物治疗产品中hmw聚集体的存在可能会影响药物功效，并增加患者的不良免疫应答的风险。因此，将生物治疗产品中的hmw物种的水平作为关键质量属性进行监测。
2、hmw物种在生物治疗剂中的不良影响的另外的潜在机制是存在宿主细胞蛋白(hcp)。残余的宿主细胞蛋白(hcp)的存在可能会引起生物制药产品的潜在安全风险和制造的问题。由于重组dna技术已广泛用于在宿主细胞中产生生物制药产品，因此有必要去除杂质以获得具有高纯度的生物制药产品。在进行临床研究之前，进行纯化生物处理之后的任何残余杂质应以可接受地低的水平存在。具体地，源自哺乳动物表达系统(例如，中国仓鼠卵巢(cho)细胞)的残余hcp可能危及产品安全性、质量和稳定性。即使痕量的特定hcp有时也可能引起免疫原性应答或不令人期望的修饰。因此，需要监测药物产品中以及制造过程期间的宿主细胞蛋白。
3、hcp可能通过多种不同途径最终成为最终药物物质。例如，hcp可以与生物治疗剂结合，从而防止其在纯化期间被去除。可替代地，hcp可以与生物治疗剂一起在未结合的状态下共纯化。理解hcp污染的机制可能有助于用于防止进一步污染的过程开发。
4、大多数单克隆抗体(mab)纯化技术包含初始亲和色谱法步骤(例如蛋白a亲和色谱法)，随后是若干个抛光步骤。蛋白a洗脱液中hcp的存在主要是由于与柱树脂/配体或mab的相互作用。蛋白a纯化后由于柱树脂相互作用而保留的hcp可能会在随后的抛光步骤中被去除。然而，与mab相关的hcp难以去除，并且可能从纯化过程中逃脱。鉴定共洗脱hcp并理解上述相互作用机制对于过程开发至关重要。
5、对生物制药产品中的hcp杂质的鉴定由于样品中的蛋白质浓度的宽动态范围以及极高的复杂性而具有挑战性。具体地，样品(如治疗蛋白)中至少一种高丰度蛋白质或肽的存在会对样品中的极低丰度的蛋白质的检测、鉴定和定量造成技术障碍。此外，生物治疗产品的hmw级分中hcp的存在以及所述hcp对如不稳定性或免疫原性等不良影响的可能促成作用尚未得到广泛表征。
6、因此，需要用于以灵敏且特异的方式鉴定、表征和去除生物治疗产品中的宿主细胞蛋白的方法和系统。
技术实现思路
1、开发了一种用于在使包含所关注的蛋白质的样品经受液相色谱法-质谱法(lc-ms)分析之前，使用尺寸排阻色谱法(sec)作为正交分离方法来鉴定hcp的方法。包含所关注的蛋白质和至少一种hcp的样品可以分离为例如高分子量(hmw)级分、主级分、尾部级分和/或低分子量(lmw)级分，其中所述所关注的蛋白质以远高于所述至少一种hcp的丰度的丰度存在。如抗体、抗体融合蛋白、受体或受体融合蛋白等生物治疗剂可以比hcp大得多，并且可以基于大小而有效地与hcp分离。hcp富集到高丰度的所关注的蛋白质耗竭的级分中允许使用lc-ms分析来更好地鉴定hcp。本公开描述了对用于hcp鉴定的基于sec的方法的优化，包含示例性经优化的变性条件、消化条件、蛋白质上样量、sec级分划分、表面活性剂纳入和酸沉淀。
2、还开发了一种用于使用sec来表征hcp与所关注的蛋白质的结合的方法。理解hcp与所关注的蛋白质的结合特性非常有价值，例如以理解样品(例如，药物物质)中的宿主细胞蛋白污染的机制。与所关注的蛋白质结合的hcp在sec中将比未结合的hcp更早洗脱。在轻度变性条件下，例如在20％的乙腈中，与所关注的蛋白质的弱hcp结合将消失，并且hcp将表现出相较于非变性条件下的分离向较低分子量的sec级分的移位，而与所关注的蛋白质的强hcp结合将基本上不受影响。在强变性条件下，例如在12mm的月桂酰肌氨酸钠和12mm的脱氧胆酸钠中，有效地与所关注的蛋白质的所有hcp结合可能消失。通过比较hcp在非变性条件和变性条件下的分离概况，可以确定hcp与所关注的蛋白质的结合特性。
3、另外开发了一种用于鉴定hcp杂质、对hcp杂质进行定量和从所关注的样品(例如生物治疗产品)中去除hcp杂质的方法。具体地，本公开证明了，相关hcp可能由于与生物治疗产品中包含的所关注的蛋白质的聚集体或多聚体的特异性相互作用而极大富集在所述产品的hmw级分中。hcp可以使用对生物治疗产品的sec分析，随后是对sec级分的分析和比较来鉴定和定量。例如，可以使药物物质(ds)经受原生消化、sec分析、成为hmw级分、单体级分和lmw级分的分级分离、进一步样品制备(如变性、还原、消化和烷基化)以及液相色谱法-串联质谱法(lc-ms/ms)分析，以鉴定富集在生物治疗产品的hmw级分中的hcp并对所述hcp进行定量。可以开发生物治疗产品ds的每种sec级分中存在的hcp的概况，以确定是否可以通过分离和去除sec级分来改进产品，例如通过降低相关hcp杂质的丰度。例如，此确定可以基于hcp的浓度和/或丰度、富集在特定sec级分中的hcp的百分比以及在生物治疗产品中纳入特定hcp的已知风险来进行。基于此确定，可以通过添加sec步骤以去除含有富集的hcp的hmw级分，由此提高生物治疗产品的安全性和功效来改进用于采集生物治疗产品样品(例如，ds)并对所述生物治疗产品样品进行纯化的过程。
4、本公开提供了一种用于鉴定样品中的hcp杂质的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括：(a)使包含至少一种所关注的蛋白质和至少一种hcp杂质的样品经受尺寸排阻色谱法(sec)分析，以产生级分；以及(b)使所述级分经受lc-ms分析，以鉴定所述至少一种hcp杂质。
5、在一个方面中，所述至少一种所关注的蛋白质为抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段或蛋白质药物产品。
6、在一个方面中，上样到所述sec柱上的蛋白质的量介于约0.5mg与约20mg之间、介于约1mg与约10mg之间、介于约8mg与约12mg之间，为约1mg、约5mg、约10mg或约20mg。在一具体方面中，上样到所述sec柱上的蛋白质的量为约10mg。
7、在一个方面中，用于所述sec分析的流动相包括约10mm的磷酸盐和约150mm的nacl。在另一个方面中，用于所述sec分析的流动相为变性流动相。在一进一步方面中，用于所述sec分析的流动相为非变性流动相。
8、在一个方面中，用于所述sec分析的流动相包括乙腈，任选地其中所述乙腈的浓度介于约5％v/v与约20％v/v之间、介于约10％v/v与约20％v/v之间、介于约15％v/v与约20％v/v之间，为约5％v/v、约10％v/v、约15％v/v或约20％v/v。在一具体方面中，所述乙腈的浓度为约20％v/v。
9、在一个方面中，用于所述sec分析的流动相包括至少一种表面活性剂，任选地其中所述至少一种表面活性剂的浓度介于约6mm与约36mm之间，为约12mm或约24mm。在一具体方面中，所述至少一种表面活性剂为洗涤剂。在一更具体的方面中，所述至少一种洗涤剂选自由脱氧胆酸钠、月桂酰肌氨酸钠以及其组合组成的组。在一进一步具体方面中，所述至少一种洗涤剂为脱氧胆酸钠和月桂酰肌氨酸钠，其中脱氧胆酸钠的浓度为约12mm，并且月桂酰肌氨酸钠的浓度为约12mm。
10、在一个方面中，所述级分包括高分子量(hmw)级分、主级分和低分子量(lmw)级分。在一具体方面中，所述级分进一步包括尾部级分。在另一个具体方面中，所述hmw级分包含介于约0.3柱体积(cv)与约5毫吸光度单位(mau)之间的洗脱液。在一进一步具体方面中，所述主级分包含介于约5mau与约40mau之间的洗脱液。在又另一个具体方面中，所述尾部级分包含介于约40mau与约10mau之间或介于约40mau与约3mau之间的洗脱液。在仍另一个具体方面中，所述lmw级分包含介于约10mau与约1.1cv之间或介于约3mau与约1.1cv之间的洗脱液。
11、在一个方面中，所述方法进一步包括在步骤(b)的所述lc-ms分析之前，使所述级分经受酶促消化。在一具体方面中，所述酶促消化为有限消化。在另一个具体方面中，所述酶促消化是通过使所述级分与胰蛋白酶接触来进行的。在一进一步具体方面中，所述酶促消化是通过使所述级分与消化酶以介于约1:100与约1:2000之间、约1:100、约1:200、约1:300、约1:400、约1:500、约1:1000或约1:2000的酶与蛋白质的比率接触来进行的。在仍另一个具体方面中，对于所述hmw级分来说，所述酶与蛋白质的比率为约1:200。在另一个具体方面中，对于所述主级分来说，所述酶与蛋白质的比率为约1:2000。在一进一步具体方面中，对于所述尾部级分来说，所述酶与蛋白质的比率为约1:500。在又另一个具体方面中，对于所述lmw级分来说，所述酶与蛋白质的比率为约1:200。
12、在一个方面中，所述方法进一步包括在步骤(b)的所述lc-ms分析之前，使所述级分经受酸沉淀。在一具体方面中，所述酸沉淀包括使所述级分与约1％的三氟乙酸接触。
13、在一个方面中，步骤(b)的所述液相色谱法包括反相液相色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法、亲水相互作用色谱法、混合模式色谱法或其组合。
14、在一个方面中，所述质谱仪为电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或基于orbitrap的质谱仪，其中所述质谱仪耦接到所述液相色谱法系统。
15、本公开提供了一种用于鉴定样品中的宿主细胞蛋白(hcp)杂质的另外的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括：(a)使包含至少一种所关注的蛋白质和至少一种hcp杂质的样品经受尺寸排阻色谱法(sec)分析，以产生级分，其中用于所述sec分析的流动相包括约12mm的月桂酰肌氨酸钠和约12mm的脱氧胆酸钠；(b)使所述级分经受酸沉淀，以产生洗涤剂耗竭的级分，其中所述酸沉淀包括使所述级分与约1％的三氟乙酸接触；(c)使所述洗涤剂耗竭的级分经受缓冲液交换，以产生经缓冲液交换的级分；(d)使所述经缓冲液交换的级分经受有限消化，以产生肽消化物，其中所述有限消化包括使所述经缓冲液交换的级分与胰蛋白酶以介于约1:200与约1:2000之间的酶与底物的比率接触；以及(e)使所述肽消化物经受lc-ms分析，以鉴定所述至少一种hcp杂质。
16、在一个方面中，所述至少一种所关注的蛋白质为抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段或蛋白质药物产品。
17、在一个方面中，上样到所述sec柱上的蛋白质的量介于约0.5mg与约20mg之间、介于约1mg与约10mg之间、介于约8mg与约12mg之间，为约1mg、约5mg、约10mg或约20mg。在一具体方面中，上样到所述sec柱上的蛋白质的量为约10mg。
18、在一个方面中，所述级分包括高分子量(hmw)级分、主级分和低分子量(lmw)级分。在一具体方面中，所述级分进一步包括尾部级分。在另一个具体方面中，所述hmw级分包含介于约0.3柱体积(cv)与约5毫吸光度单位(mau)之间的洗脱液。在一进一步具体方面中，所述主级分包含介于约5mau与约40mau之间的洗脱液。在又另一个具体方面中，所述尾部级分包含介于约40mau与约10mau之间或介于约40mau与约3mau之间的洗脱液。在仍另一个具体方面中，所述lmw级分包含介于约10mau与约1.1cv之间或介于约3mau与约1.1cv之间的洗脱液。
19、在一个方面中，步骤(e)的所述液相色谱法包括反相液相色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法、亲水相互作用色谱法、混合模式色谱法或其组合。
20、在一个方面中，所述质谱仪为电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或基于orbitrap的质谱仪，其中所述质谱仪耦接到所述液相色谱法系统。
21、本公开还提供了一种用于表征hcp杂质与所关注的蛋白质的结合的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括：(a)获得样品，所述样品包含所关注的蛋白质和至少一种hcp杂质；(b)使用非变性流动相使所述样品经受尺寸排阻色谱法(sec)分析，以产生原生级分；(c)使用变性流动相使(a)的所述样品经受sec分析，以产生经变性的级分；(d)使所述原生级分和所述经变性的级分经受lc-ms分析，以产生所述至少一种hcp杂质的原生分离概况和经变性的分离概况；以及(e)将所述原生分离概况与所述经变性的分离概况进行比较，以表征所述至少一种hcp杂质与所述所关注的蛋白质的所述结合。
22、在一个方面中，所述所关注的蛋白质为抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段或蛋白质药物产品。
23、在一个方面中，上样到所述sec柱上的蛋白质的量介于约0.5mg与约20mg之间、介于约1mg与约10mg之间、介于约8mg与约12mg之间，为约1mg、约5mg、约10mg或约20mg。在一具体方面中，上样到所述sec柱上的蛋白质的量为约10mg。
24、在一个方面中，用于所述sec分析的流动相包括约10mm的磷酸盐和约150mm的nacl。在另一个方面中，所述变性流动相为温和变性流动相。
25、在一个方面中，所述变性流动相包括乙腈，任选地其中所述乙腈的浓度介于约5％v/v与约20％v/v之间、介于约10％v/v与约20％v/v之间、介于约15％v/v与约20％v/v之间，为约5％v/v、约10％v/v、约15％v/v或约20％v/v。在一具体方面中，所述乙腈的浓度为约20％v/v。
26、在一个方面中，所述级分包括高分子量(hmw)级分、主级分和低分子量(lmw)级分。在一具体方面中，所述级分进一步包括尾部级分。在另一个具体方面中，所述hmw级分包含介于约0.3柱体积(cv)与约5毫吸光度单位(mau)之间的洗脱液。在一进一步具体方面中，所述主级分包含介于约5mau与约40mau之间的洗脱液。在又另一个具体方面中，所述尾部级分包含介于约40mau与约10mau之间或介于约40mau与约3mau之间的洗脱液。在仍另一个具体方面中，所述lmw级分包含介于约10mau与约1.1cv之间或介于约3mau与约1.1cv之间的洗脱液。
27、在一个方面中，所述方法进一步包括在步骤(d)的所述lc-ms分析之前，使所述级分经受酶促消化。在一具体方面中，所述酶促消化为有限消化。在另一个具体方面中，所述酶促消化是通过使所述级分与胰蛋白酶接触来进行的。在一进一步具体方面中，所述酶促消化是通过使所述级分与消化酶以介于约1:100与约1:2000之间、约1:100、约1:200、约1:300、约1:400、约1:500、约1:1000或约1:2000的酶与蛋白质的比率接触来进行的。在仍另一个具体方面中，对于所述hmw级分来说，所述酶与蛋白质的比率为约1:200。在另一个具体方面中，对于所述主级分来说，所述酶与蛋白质的比率为约1:2000。在一进一步具体方面中，对于所述尾部级分来说，所述酶与蛋白质的比率为约1:500。在又另一个具体方面中，对于所述lmw级分来说，所述酶与蛋白质的比率为约1:200。
28、在一个方面中，步骤(d)的所述液相色谱法包括反相液相色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法、亲水相互作用色谱法、混合模式色谱法或其组合。
29、在一个方面中，所述质谱仪为电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或基于orbitrap的质谱仪，其中所述质谱仪耦接到所述液相色谱法系统。
30、本公开提供了一种用于鉴定样品中的hcp杂质的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括：(a)将包含至少一种所关注的蛋白质和至少一种hcp杂质的样品与解离试剂组合，以产生第一组合；(b)使所述第一组合经受酸沉淀，以产生解离试剂耗竭的级分；以及(c)使所述解离试剂耗竭的级分经受液相色谱法-质谱法分析，以鉴定所述至少一种hcp杂质。
31、在一个方面中，所述至少一种所关注的蛋白质为抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段或蛋白质药物产品。
32、在一个方面中，所述样品在所述解离试剂中温育约5分钟至约120分钟、约15分钟、约30分钟、约60分钟或约120分钟。
33、在一个方面中，所述解离试剂包括至少一种表面活性剂，任选地其中所述至少一种表面活性剂的浓度介于约20mm与约120mm之间，为约20mm、约40mm、约60mm、约100mm或约120mm。
34、在一个方面中，所述至少一种表面活性剂为洗涤剂。
35、在一个方面中，所述至少一种洗涤剂选自由脱氧胆酸钠、月桂酰肌氨酸钠以及其组合组成的组。
36、在一个方面中，所述至少一种洗涤剂为月桂酰肌氨酸钠，其中月桂酰肌氨酸钠的浓度介于约20mm与约120mm之间，为约20mm、约40mm、约60mm、约100mm或约120mm。
37、在一个方面中，所述至少一种洗涤剂为脱氧胆酸钠和月桂酰肌氨酸钠，其中脱氧胆酸钠的浓度介于约20mm与约120mm之间，为约20mm、约40mm、约60mm、约100mm或约120mm，并且月桂酰肌氨酸钠的浓度介于约20mm与约120mm之间，为约20mm、约40mm、约60mm、约100mm或约120mm。
38、在一个方面中，所述至少一种洗涤剂为脱氧胆酸钠，其中脱氧胆酸钠的浓度介于约20mm与约120mm之间，为约20mm、约40mm、约60mm、约100mm或约120mm。
39、在一个方面中，所述方法进一步包括在步骤(c)的所述液相色谱法-质谱法分析之前，使所述解离试剂耗竭的级分经受酶促消化，以产生肽消化物。
40、在一个方面中，所述酶促消化为有限消化。
41、在一个方面中，所述酶促消化是通过使所述解离试剂耗竭的级分与胰蛋白酶接触来进行的。
42、在一个方面中，所述酶促消化是通过使所述解离试剂耗竭的级分与消化酶以介于约1:100与约1:2000之间、介于约1:200与约1:2000之间、约1:100、约1:200、约1:300、约1:400、约1:500、约1:1000或约1:2000的酶与蛋白质的比率接触来进行的。
43、在一个方面中，所述酶与蛋白质的比率为约1:200。
44、在一个方面中，所述方法进一步包括在步骤(c)的所述液相色谱法-质谱法分析之前，使所述肽消化物脱盐。
45、在一个方面中，所述酸沉淀温育约5分钟至约60分钟、约5分钟或约60分钟。
46、在一个方面中，所述酸沉淀包括使所述第一组合与约2.5％至约10％的三氟乙酸、约2.5％的三氟乙酸、约5％的三氟乙酸、约7.5％的三氟乙酸或约10％的三氟乙酸接触。
47、在一个方面中，所述液相色谱法包括反相液相色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法、亲水相互作用色谱法、混合模式色谱法或其组合。
48、在一个方面中，所述质谱仪为电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或基于orbitrap的质谱仪，其中所述质谱仪耦接到所述液相色谱法系统。
49、本公开提供了一种用于鉴定样品中的hcp杂质的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括：(a)将包含至少一种所关注的蛋白质和至少一种hcp杂质的样品与解离试剂组合，以产生第一组合；(b)使所述第一组合经受酸沉淀，以产生解离试剂耗竭的级分；(c)使所述解离试剂耗竭的级分经受缓冲液交换，以产生经缓冲液交换的级分；(d)使所述经缓冲液交换的级分经受酶促消化，以产生肽消化物；以及(e)使所述肽消化物经受液相色谱法-质谱法分析，以鉴定所述至少一种hcp杂质。
50、在一个方面中，所述至少一种所关注的蛋白质为抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段或蛋白质药物产品。
51、在另一个方面中，所述解离试剂包括至少一种表面活性剂，任选地其中所述至少一种表面活性剂的浓度介于约20mm与约120mm之间，为约20mm、约40mm、约60mm、约100mm或约120mm。
52、在另一个方面中，所述至少一种表面活性剂为洗涤剂。
53、在又另一个方面中，所述至少一种洗涤剂选自由脱氧胆酸钠、月桂酰肌氨酸钠以及其组合组成的组。
54、在一个方面中，所述第一组合在步骤(b)的所述酸沉淀之前温育约5分钟至约120分钟、约5分钟、约15分钟、约30分钟、约60分钟、约90分钟或约120分钟。
55、在另一个方面中，所述至少一种洗涤剂为月桂酰肌氨酸钠，其中月桂酰肌氨酸钠的浓度介于约20mm与约120mm之间，为约20mm、约40mm、约60mm、约100mm或约120mm。
56、在另一个方面中，所述至少一种洗涤剂为脱氧胆酸钠和月桂酰肌氨酸钠，其中脱氧胆酸钠的浓度介于约20mm与约120mm之间，为约20mm、约40mm、约60mm、约100mm或约120mm，并且月桂酰肌氨酸钠的浓度介于约20mm与约120mm之间，为约20mm、约40mm、约60mm、约100mm或约120mm。
57、在又另一个方面中，所述至少一种洗涤剂为脱氧胆酸钠，其中脱氧胆酸钠的浓度介于约20mm与约120mm之间，为约20mm、约40mm、约60mm、约100mm或约120mm。
58、在一个方面中，所述酶促消化为有限消化。
59、在一个方面中，所述酶促消化是通过使所述经缓冲液交换的级分与胰蛋白酶接触来进行的。
60、在另一个方面中，所述酶促消化是通过使所述经缓冲液交换的级分与消化酶以介于约1:100与约1:2000之间、介于约1:200与约1:2000之间、约1:100、约1:200、约1:300、约1:400、约1:500、约1:1000或约1:2000的酶与蛋白质的比率接触来进行的。
61、在又另一个方面中，所述酶与蛋白质的比率为约1:200。
62、在一个方面中，所述方法进一步包括在步骤(e)的所述液相色谱法-质谱法分析之前，使所述肽消化物脱盐。
63、在一个方面中，所述酸沉淀温育约5分钟至约60分钟、约5分钟或约60分钟。
64、在一个方面中，所述酸沉淀包括使所述第一组合与约2.5％至约10％的三氟乙酸、约2.5％的三氟乙酸、约5％的三氟乙酸、约7.5％的三氟乙酸或约10％的三氟乙酸接触。
65、在一个方面中，所述液相色谱法包括反相液相色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法、亲水相互作用色谱法、混合模式色谱法或其组合。
66、本公开进一步提供了一种用于制备生物治疗产品的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括(a)使包含至少一种所关注的蛋白质和至少一种宿主细胞蛋白(hcp)杂质的第一样品经受尺寸排阻色谱法(sec)分析，以产生多种级分；(b)使所述多种级分经受液相色谱法-串联质谱法(lc-ms/ms)分析，以确定所述至少一种hcp杂质的身份和量；(c)使用所述身份和所述量来确定所述至少一种hcp杂质是否是所述多种级分中的至少一种级分的相关杂质；(d)使包含所述至少一种所关注的蛋白质和所述至少一种hcp杂质的第二样品经受sec分析，以产生第二多种级分；以及(e)使用步骤(c)的所述确定，从步骤(d)的所述多种级分中去除其中所述至少一种hcp杂质为相关杂质的所述至少一种级分，以制备生物治疗产品。
67、在一个方面中，所述所关注的蛋白质为抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段、宿主细胞蛋白或蛋白质药物产品。
68、在一个方面中，用于所述sec分析的所述流动相包括约150mm的乙酸铵。
69、在一个方面中，所述至少一种hcp杂质包括脂酶、蛋白酶或其组合。在另一个方面中，所述至少一种hcp杂质包括c-c基序趋化因子。
70、在一个方面中，所述多种级分包括高分子量(hmw)级分、极高分子量(vhmw)级分、二聚体级分、单体级分、低分子量(lmw)级分、尾部级分或其组合。
71、在一个方面中，所述至少一种hcp杂质为相关杂质的级分为hmw级分。
72、在一个方面中，所述至少一种hcp杂质以约1000百万分率(1000ppm)至约10000ppm、约1000ppm、约2000ppm、约3000ppm、约4000ppm、约5000ppm、约6000ppm、约7000ppm、约8000ppm、约9000ppm或约10000ppm存在于级分中。
73、在一个方面中，富集在hmw级分中的所述至少一种hcp杂质的百分比介于约30％与约100％之间，为约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
74、在一个方面中，所述方法进一步包括在sec分析之前，使(a)的所述样品经受原生消化。在一具体方面中，所述原生消化为有限消化。在另一个具体方面中，所述原生消化是通过使所述样品与胰蛋白酶接触来进行的。
75、在一个方面中，所述lc-ms/ms分析包括反相液相色谱法、离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法、强阳离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、蛋白a色谱法、疏水相互作用色谱法、亲水相互作用色谱法、混合模式色谱法或其组合。
76、在一个方面中，所述lc-ms/ms分析包括平行反应监测。
77、本公开提供了一种用于制备生物治疗产品的另外的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括使包含所关注的蛋白质、至少一种hmw物种和至少一种hcp杂质的样品经受一个或多个色谱法步骤，所述一个或多个色谱法步骤降低所述至少一种hcp杂质的丰度，其中所述至少一种hcp杂质与所述至少一种hmw物种相互作用。
78、在一个方面中，所述至少一种hcp杂质与所述至少一种hmw物种的相互作用可以通过使所述至少一种hmw物种富集来鉴定。在一具体方面中，所述富集包括使包含所述至少一种hmw物种和所述至少一种hcp杂质的样品经受sec。在一更具体的方面中，所述方法进一步包括使所述至少一种hmw物种和所述至少一种hcp杂质经受缓冲液交换、原生消化、变性、分子量过滤、一个或多个另外的色谱法步骤和/或质谱法分析。
79、在一个方面中，所述所关注的蛋白质为抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段、宿主细胞蛋白或蛋白质药物产品。
80、在一个方面中，所述至少一种hcp杂质包括脂酶、蛋白酶或其组合。在另一个方面中，所述至少一种hcp杂质包括c-c基序趋化因子。
81、在一个方面中，所述至少一种hmw物种包括二聚体、聚集体或其组合。
82、在一个方面中，所述一个或多个色谱法步骤包括反相液相色谱法、离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法、强阳离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、蛋白a色谱法、疏水相互作用色谱法、亲水相互作用色谱法、混合模式色谱法或其组合。
83、当结合以下描述和附图考虑时，将更好地认识和理解本发明的这些方面和其它方面。以下描述虽然表明各个实施例以及其许多具体细节，但是其是以说明而非限制的方式给出的。在本发明的范围内可以进行许多替换、修改、添加或重新布置。
84、本专利或申请文件含有至少一张彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开物的副本。
1.一种用于鉴定样品中的宿主细胞蛋白(hcp)杂质的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种所关注的蛋白质为抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段或蛋白质药物产品。
3.根据权利要求1所述的方法，其中上样到所述sec柱上的蛋白质的量介于约0.5mg与约20mg之间、介于约1mg与约10mg之间、介于约8mg与约12mg之间，为约1mg、约5mg、约10mg或约20mg。
4.根据权利要求3所述的方法，其中上样到所述sec柱上的蛋白质的量为约10mg。
5.根据权利要求1所述的方法，其中用于所述sec分析的流动相包括约10mm的磷酸盐和约150mm的nacl。
6.根据权利要求1所述的方法，其中用于所述sec分析的流动相为变性流动相。
7.根据权利要求1所述的方法，其中用于所述sec分析的流动相为非变性流动相。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述流动相包括乙腈，任选地其中所述乙腈的浓度介于约5％v/v与约20％v/v之间、介于约10％v/v与约20％v/v之间、介于约15％v/v与约20％v/v之间，为约5％v/v、约10％v/v、约15％v/v或约20％v/v。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述乙腈的浓度为约20％v/v。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述流动相包括至少一种表面活性剂，任选地其中所述至少一种表面活性剂的浓度介于约6mm与约36mm之间，为约12mm、约24mm或约40mm。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述至少一种表面活性剂为洗涤剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少一种洗涤剂选自由脱氧胆酸钠、月桂酰肌氨酸钠以及其组合组成的组。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述至少一种洗涤剂为脱氧胆酸钠和月桂酰肌氨酸钠，其中脱氧胆酸钠的浓度为约12mm，并且月桂酰肌氨酸钠的浓度为约12mm。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述级分包括高分子量(hmw)级分、主级分和低分子量(lmw)级分。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述级分进一步包括尾部级分。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述hmw级分包含介于约0.3柱体积(cv)与约5毫吸光度单位(mau)之间的洗脱液。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述主级分包含介于约5mau与约40mau之间的洗脱液。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述尾部级分包含介于约40mau与约10mau之间或介于约40mau与约3mau之间的洗脱液。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述lmw级分包含介于约10mau与约1.1cv之间或介于约3mau与约1.1cv之间的洗脱液。
20.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在步骤(b)的所述lc-ms分析之前，使所述级分经受酶促消化。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述酶促消化为有限消化。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述酶促消化是通过使所述级分与胰蛋白酶接触来进行的。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述酶促消化是通过使所述级分与消化酶以介于约1:100与约1:2000之间、介于约1:200与约1:2000之间、约1:100、约1:200、约1:300、约1:400、约1:500、约1:1000或约1:2000的酶与蛋白质的比率接触来进行的。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述酶与蛋白质的比率为约1:200。
25.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在步骤(b)的所述lc-ms分析之前，使所述级分经受酸沉淀。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述酸沉淀包括使所述级分与约1％的三氟乙酸接触。
27.根据权利要求1(b)所述的方法，其中所述液相色谱法包括反相液相色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法、亲水相互作用色谱法、混合模式色谱法或其组合。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述质谱仪为电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或基于orbitrap的质谱仪，其中所述质谱仪耦接到所述液相色谱法系统。
29.一种用于鉴定样品中的宿主细胞蛋白(hcp)杂质的方法，所述方法包括：
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述至少一种所关注的蛋白质为抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段或蛋白质药物产品。
31.根据权利要求29所述的方法，其中上样到所述sec柱上的蛋白质的量介于约0.5mg与约20mg之间、介于约1mg与约10mg之间、介于约8mg与约12mg之间，为约1mg、约5mg、约10mg或约20mg。
32.根据权利要求29所述的方法，其中上样到所述sec柱上的蛋白质的量为约10mg。
33.根据权利要求29所述的方法，其中所述级分包括高分子量(hmw)级分、主级分和低分子量(lmw)级分。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述级分进一步包括尾部级分。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述hmw级分包含介于约0.3柱体积(cv)与约5毫吸光度单位(mau)之间的洗脱液。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述主级分包含介于约5mau与约40mau之间的洗脱液。
37.根据权利要求34所述的方法，其中所述尾部级分包含介于约40mau与约10mau之间或介于约40mau与约3mau之间的洗脱液。
38.根据权利要求34所述的方法，其中所述lmw级分包含介于约10mau与约1.1cv之间或介于约3mau与约1.1cv之间的洗脱液。
39.根据权利要求29(e)所述的方法，其中所述液相色谱法包括反相液相色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法、亲水相互作用色谱法、混合模式色谱法或其组合。
40.根据权利要求29所述的方法，其中所述质谱仪为电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或基于orbitrap的质谱仪，其中所述质谱仪耦接到所述液相色谱法系统。
41.一种用于表征宿主细胞蛋白(hcp)杂质与所关注的蛋白质的结合的方法，所述方法包括：
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述所关注的蛋白质为抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段或蛋白质药物产品。
43.根据权利要求41所述的方法，其中上样到所述sec柱上的蛋白质的量介于约0.5mg与约20mg之间、介于约1mg与约10mg之间、介于约8mg与约12mg之间，为约1mg、约5mg、约10mg或约20mg。
44.根据权利要求43所述的方法，其中上样到所述sec柱上的蛋白质的量为约10mg。
45.根据权利要求41所述的方法，其中所述流动相包括约10mm的磷酸盐和约150mm的nacl。
46.根据权利要求41所述的方法，其中所述变性流动相为温和变性流动相。
47.根据权利要求41所述的方法，其中所述变性流动相包括乙腈，任选地其中所述乙腈的浓度介于约5％v/v与约20％v/v之间、介于约10％v/v与约20％v/v之间、介于约15％v/v与约20％v/v之间，为约5％v/v、约10％v/v、约15％v/v或约20％v/v。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述乙腈的浓度为约20％v/v。
49.根据权利要求41所述的方法，其中所述级分包括高分子量(hmw)级分、主级分和低分子量(lmw)级分。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述级分进一步包括尾部级分。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述hmw级分包含介于约0.3柱体积(cv)与约5毫吸光度单位(mau)之间的洗脱液。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述主级分包含介于约5mau与约40mau之间的洗脱液。
53.根据权利要求50所述的方法，其中所述尾部级分包含介于约40mau与约10mau之间或介于约40mau与约3mau之间的洗脱液。
54.根据权利要求50所述的方法，其中所述lmw级分包含介于约10mau与约1.1cv之间或介于约3mau与约1.1cv之间的洗脱液。
55.根据权利要求41所述的方法，其进一步包括在步骤(d)的所述lc-ms分析之前，使所述级分经受酶促消化。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述酶促消化为有限消化。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述酶促消化是通过使所述级分与胰蛋白酶接触来进行的。
58.根据权利要求55所述的方法，其中所述酶促消化是通过使所述级分与消化酶以介于约1:100与约1:2000之间、介于约1:200与约1:2000之间、约1:100、约1:200、约1:300、约1:400、约1:500、约1:1000或约1:2000的酶与蛋白质的比率接触来进行的。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述酶与蛋白质的比率为约1:200。
60.根据权利要求41(d)所述的方法，其中所述液相色谱法包括反相液相色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法、亲水相互作用色谱法、混合模式色谱法或其组合。
61.根据权利要求41所述的方法，其中所述质谱仪为电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或基于orbitrap的质谱仪，其中所述质谱仪耦接到所述液相色谱法系统。
62.一种用于鉴定样品中的宿主细胞蛋白(hcp)杂质的方法，所述方法包括：
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述至少一种所关注的蛋白质为抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段或蛋白质药物产品。
64.根据权利要求62所述的方法，其中所述样品在所述解离试剂中温育约5分钟至约120分钟、约15分钟、约30分钟、约60分钟或约120分钟。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述解离试剂包括至少一种表面活性剂，任选地其中所述至少一种表面活性剂的浓度介于约20mm与约120mm之间，为约20mm、约40mm、约60mm、约100mm或约120mm。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述至少一种表面活性剂为洗涤剂。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述至少一种洗涤剂选自由脱氧胆酸钠、月桂酰肌氨酸钠以及其组合组成的组。
68.根据权利要求66所述的方法，其中所述至少一种洗涤剂为月桂酰肌氨酸钠，其中月桂酰肌氨酸钠的浓度介于约20mm与约120mm之间，为约20mm、约40mm、约60mm、约100mm或约120mm。
69.根据权利要求66所述的方法，其中所述至少一种洗涤剂为脱氧胆酸钠和月桂酰肌氨酸钠，其中脱氧胆酸钠的浓度介于约20mm与约120mm之间，为约20mm、约40mm、约60mm、约100mm或约120mm，并且月桂酰肌氨酸钠的浓度介于约20mm与约120mm之间，为约20mm、约40mm、约60mm、约100mm或约120mm。
70.根据权利要求66所述的方法，其中所述至少一种洗涤剂为脱氧胆酸钠，其中脱氧胆酸钠的浓度介于约20mm与约120mm之间，为约20mm、约40mm、约60mm、约100mm或约120mm。
71.根据权利要求66所述的方法，其进一步包括在步骤(c)的所述液相色谱法-质谱法分析之前，使所述解离试剂耗竭的级分经受酶促消化，以产生肽消化物。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述酶促消化为有限消化。
73.根据权利要求71所述的方法，其中所述酶促消化是通过使所述解离试剂耗竭的级分与胰蛋白酶接触来进行的。
74.根据权利要求71所述的方法，其中所述酶促消化是通过使所述解离试剂耗竭的级分与消化酶以介于约1:100与约1:2000之间、介于约1:200与约1:2000之间、约1:100、约1:200、约1:300、约1:400、约1:500、约1:1000或约1:2000的酶与蛋白质的比率接触来进行的。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述酶与蛋白质的比率为约1:200。
76.根据权利要求71所述的方法，其进一步包括在步骤(c)的所述液相色谱法-质谱法分析之前，使所述肽消化物脱盐。
77.根据权利要求62所述的方法，其中所述酸沉淀温育约5分钟至约60分钟、约5分钟或约60分钟。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述酸沉淀包括使所述第一组合与约2.5％至约10％的三氟乙酸、约2.5％的三氟乙酸、约5％的三氟乙酸、约7.5％的三氟乙酸或约10％的三氟乙酸接触。
79.根据权利要求62所述的方法，其中所述液相色谱法包括反相液相色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法、亲水相互作用色谱法、混合模式色谱法或其组合。
80.根据权利要求62所述的方法，其中所述质谱仪为电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或基于orbitrap的质谱仪，其中所述质谱仪耦接到所述液相色谱法系统。
81.一种用于鉴定样品中的宿主细胞蛋白(hcp)杂质的方法，所述方法包括：
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述至少一种所关注的蛋白质为抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段或蛋白质药物产品。
83.根据权利要求81所述的方法，其中所述解离试剂为至少一种表面活性剂，任选地其中所述至少一种表面活性剂的浓度介于约20mm与约120mm之间，为约20mm、约40mm、约60mm、约100mm或约120mm。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述至少一种表面活性剂为洗涤剂。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述至少一种洗涤剂选自由脱氧胆酸钠、月桂酰肌氨酸钠以及其组合组成的组。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述第一组合在步骤(b)的所述酸沉淀之前温育约5分钟至约120分钟、约5分钟、约15分钟、约30分钟、约60分钟、约90分钟或约120分钟。
87.根据权利要求84所述的方法，其中所述至少一种洗涤剂为月桂酰肌氨酸钠，其中月桂酰肌氨酸钠的浓度介于约20mm与约120mm之间，为约20mm、约40mm、约60mm、约100mm或约120mm。
88.根据权利要求84所述的方法，其中所述至少一种洗涤剂为脱氧胆酸钠和月桂酰肌氨酸钠，其中脱氧胆酸钠的浓度介于约20mm与约120mm之间，为约20mm、约40mm、约60mm、约100mm或约120mm，并且月桂酰肌氨酸钠的浓度介于约20mm与约120mm之间，为约20mm、约40mm、约60mm、约100mm或约120mm。
89.根据权利要求84所述的方法，其中所述至少一种洗涤剂为脱氧胆酸钠，其中脱氧胆酸钠的浓度介于约20mm与约120mm之间，为约20mm、约40mm、约60mm、约100mm或约120mm。
90.根据权利要求81所述的方法，其中所述酶促消化为有限消化。
91.根据权利要求81所述的方法，其中所述酶促消化是通过使所述级分与胰蛋白酶接触来进行的。
92.根据权利要求81所述的方法，其中所述酶促消化是通过使所述级分与消化酶以介于约1:100与约1:2000之间、介于约1:200与约1:2000之间、约1:100、约1:200、约1:300、约1:400、约1:500、约1:1000或约1:2000的酶与蛋白质的比率接触来进行的。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述酶与蛋白质的比率为约1:200。
94.根据权利要求81所述的方法，其进一步包括在步骤(e)的所述液相色谱法-质谱法分析之前，使所述肽消化物脱盐。
95.根据权利要求81所述的方法，其中所述酸沉淀温育约5分钟至约60分钟、约5分钟或约60分钟。
96.根据权利要求81所述的方法，其中所述酸沉淀包括使所述第一组合与约2.5％至约10％的三氟乙酸、约2.5％的三氟乙酸、约5％的三氟乙酸、约7.5％的三氟乙酸或约10％的三氟乙酸接触。
97.根据权利要求81所述的方法，其中所述液相色谱法包括反相液相色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法、亲水相互作用色谱法、混合模式色谱法或其组合。
98.一种用于制备生物治疗产品的方法，所述方法包括：
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述所关注的蛋白质为抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段或蛋白质药物产品。
100.根据权利要求98所述的方法，其中所述sec分析的流动相包括约150mm的乙酸铵。
101.根据权利要求98所述的方法，其中所述至少一种hcp杂质包括脂酶、蛋白酶或其组合。
102.根据权利要求98所述的方法，其中所述至少一种hcp杂质包括c-c基序趋化因子。
103.根据权利要求98所述的方法，其中所述多种级分包括高分子量(hmw)级分、极高分子量(vhmw)级分、二聚体级分、单体级分、低分子量(lmw)级分、尾部级分或其组合。
104.根据权利要求98所述的方法，其中所述至少一种hcp杂质为相关杂质的级分为hmw级分。
105.根据权利要求98所述的方法，其中所述至少一种hcp杂质以约1000百万分率(1000ppm)至约10000ppm、约1000ppm、约2000ppm、约3000ppm、约4000ppm、约5000ppm、约6000ppm、约7000ppm、约8000ppm、约9000ppm或约10000ppm存在于级分中。
106.根据权利要求98所述的方法，其中富集在hmw级分中的所述至少一种hcp杂质的百分比介于约30％与约100％之间，为约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
107.根据权利要求98所述的方法，其进一步包括在sec分析之前，使(a)的所述样品经受原生消化。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述原生消化为有限消化。
109.根据权利要求107所述的方法，其中所述原生消化是通过使所述样品与胰蛋白酶接触来进行的。
110.根据权利要求98所述的方法，其中所述lc-ms/ms分析包括反相液相色谱法、离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法、强阳离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、蛋白a色谱法、疏水相互作用色谱法、亲水相互作用色谱法、混合模式色谱法或其组合。
111.根据权利要求98所述的方法，其中所述lc-ms/ms分析包括平行反应监测。
112.一种用于制备生物治疗产品的方法，所述方法包括：使包含所关注的蛋白质、至少一种hmw物种和至少一种hcp杂质的样品经受一个或多个色谱法步骤，所述一个或多个色谱法步骤降低所述至少一种hcp杂质的丰度，其中所述至少一种hcp杂质与所述至少一种hmw物种相互作用。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述至少一种hcp杂质与所述至少一种hmw物种的相互作用可通过使所述至少一种hmw物种富集来鉴定。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述富集包括使包含所述至少一种hmw物种和所述至少一种hcp杂质的样品经受sec。
115.根据权利要求114所述的方法，其进一步包括使所述至少一种hmw物种和所述至少一种hcp杂质经受缓冲液交换、原生消化、变性、分子量过滤、一个或多个另外的色谱法步骤和/或质谱法分析。
116.根据权利要求112所述的方法，其中所述所关注的蛋白质为抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段或蛋白质药物产品。
117.根据权利要求112所述的方法，其中所述至少一种hcp杂质包括脂酶、蛋白酶或其组合。
118.根据权利要求112所述的方法，其中所述至少一种hcp杂质包括c-c基序趋化因子。
119.根据权利要求112所述的方法，其中所述至少一种hmw物种包括二聚体、聚集体或其组合。
120.根据权利要求112所述的方法，其中所述一个或多个色谱法步骤包括反相液相色谱法、离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法、强阳离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、蛋白a色谱法、疏水相互作用色谱法、亲水相互作用色谱法、混合模式色谱法或其组合。
