本公开涉及用于递送负载物(例如核酸)的脂质纳米颗粒制剂。
背景技术：
1、脂质纳米颗粒(lnp)制剂代表了核酸递送领域的一场革命。获批用于临床的脂质纳米颗粒产品的早期示例是onpattrotm。onpattrotm是基于脂质纳米颗粒的短干扰rna(sirna)药物，其用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性引起的多发性神经病。该lnp递送系统的成功为领先最重要的基于lnp的covid-19mrna疫苗的临床开发铺平了道路。
2、onpattrotmlnp制剂由四种主要的脂质组分组成，即：可电离氨基脂质、二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、胆固醇和聚乙二醇缀合的脂质(peg-脂质)，其摩尔量分别为50/10/38.5/1.5。onpattrotm仍然被认为是lnp介导疗效的研究中用于比较的黄金标准，并且目前的lnp设计方法与四组分系统几乎没有偏差。
3、在这四种组分中，可电离阳离子脂质被认为对lnp系统的体外和体内活性很重要。因此，该领域的大部分工作主要聚焦于改善这种脂质组分上。可电离阳离子脂质通常在低ph时带正电荷，这有助于与带负电荷的核酸缔合，但在生理ph时是中性的，使其在生物系统中更具生物相容性。此外，有人认为，在脂质纳米颗粒被细胞通过内吞作用(endocytosis)吸收后，这些脂质在低ph时电离的能力使得内体逃逸(endosomal escape)。这反过来又允许核酸释放到细胞内隔室(compartment)中。
4、可电离阳离子脂质以(相对于lnp中的总脂质)50mol％存在，因此占onpattrotm制剂的大部分。关于其余三种脂质组分，众所周知，peg-脂质可以用于防止lnp聚集，以及胆固醇具有稳定颗粒的功能。dspc是形成双层的脂质，人们普遍认为它在lnp膜中具有重要的结构作用。
5、报告表明，在空的onpattrotm型lnp系统中，dspc和胆固醇存在于外脂质层，但在负载有sirna的系统中，dspc和胆固醇与sirna一起内化在疏水核心中。在两种组分的低水平(低于40mol％的组合的dspc和胆固醇的含量)时，sirna包封效率逐渐降低(kulkarni etal.,2019,nanoscale,11:21733-21739)。结论是，dspc和胆固醇的存在对于sirna在lnp中的稳定包封至关重要。由于担心胆固醇的溶解度，这些研究只调查了具有高达40mol％的胆固醇含量(1:1chol/dspc)的lnp。据称，其他研究表明，胆固醇在高于ph为7.4的可电离阳离子脂质中具有有限的溶解度。有人认为，dspc必须稳定地保留胆固醇，并且未对超过40:40的chol/dspc(mol/mol)的lnp制剂进行调查，以避免因过量胆固醇的存在而产生歧义。
6、其他研究调查了胆固醇对含有可电离阳离子脂质和胆固醇的双组分脂质体复合物(lipoplex)系统的影响，但这些研究使用了1:1摩尔比的两种脂质组分，并且没有检验提高胆固醇含量(例如高于50mol％)的影响(cheng和lee,2016,advanced drug deliveryreviews,99:129-137；sakurai et al.,2001,european journal of pharmaceutics andbiopharmaceutics,52:165-172；dabkowska et al.,2012,j.r.soc.interface,9:548-561；yoshioka et al.,2009,journal of liposome research,19(2):141-147)。其他研究已经检验了胆固醇对脂质体复合物形成立方相的影响，但(使用薄膜水合)形成的脂质分散体含有高水平的磷脂(tenchov et al.,2006,biophysical journal,91:2508-2516)。
7、在体内进行的研究检验了含有磷脂/胆固醇的大型单层脂质体(luv)，发现胆固醇增加了luv的循环寿命，但胆固醇对增加循环寿命的影响稳定在30mol％(semple et al.,1996,biochemistry,35(8):2521-2525)。
8、美国专利号11,191,849公开了mrna-lnp，其具有55mol％可电离阳离子脂质、41mol％胆固醇和3.3mol％eg2000-c-dma。与基础组成(以1.6/55/33/11mol％的peg-2000-c-dma/阳离子脂质/胆固醇/dspc)相比，小鼠服用lnp后的炎症反应减少，但不影响效力。所观察到的结果部分归因于高于通常的peg-脂质缀合物含量(>3mol％)。
9、尽管本领域取得了上述进展，但仍然持续需要具有用于递送核酸的理想性质的lnp制剂。
技术实现思路
1、本公开解决了本领域的一个或多个问题和/或提供了其有用的替代方案。
2、本公开部分基于以下发现：相对于onpattrotmlnp，具有高甾醇含量和低水平的可电离脂质的lnp(例如，明显大于38.5mol％的甾醇，例如胆固醇)具有高的核酸包封效率。此外，尽管脂质组成与“金标准”基准存在显著差异，但本文所述的lnp在体外和体内核酸递送效力与onpattrotmlnp表现相当。
3、在本公开的一个示例中，具有高水平甾醇或其衍生物的lnp表现出相比于脾脏对肝脏改善的靶向性。在一些实施例中，相对于onpattrotmlnp，相比于脾脏对肝脏的靶向性得到改善。
4、根据本发明的一个实施例，提供了一种脂质纳米颗粒，其包含：核酸负载物(cargo)分子；以在49mol％至85mol％之间的含量存在的甾醇或其衍生物；基本上不含磷脂；可电离脂质；以及以在0.5至3mol％之间的含量存在的亲水性聚合物-脂质缀合物，其中每个mol％含量是相对于脂质纳米颗粒中存在的总脂质。
5、在一个实施例中，甾醇或其衍生物以至少50mol％的含量存在和/或可电离脂质以小于48.5mol％的含量存在。
6、在另一个实施例中，甾醇或其衍生物以至少52mol％的含量存在和/或可电离脂质以小于46.5mol％的含量存在。
7、在又一个实施例中，甾醇或其衍生物以至少54mol％的含量存在和/或可电离脂质以小于44.5mol％的含量存在。
8、在另一个实施例中，甾醇或其衍生物以至少56mol％的含量存在和/或可电离脂质以小于42.5mol％的含量存在。
9、在又一个实施例中，甾醇或其衍生物以至少58mol％的含量存在和/或可电离脂质以小于40.5mol％的含量存在。
10、在另一个实施例中，甾醇或其衍生物以至少60mol％的含量存在和/或可电离脂质以小于38.5mol％的含量存在。
11、在又一个实施例中，甾醇或其衍生物以至少62mol％的含量存在和/或可电离脂质以小于36.5mol％的含量存在。
12、在又一个实施例中，甾醇或其衍生物以至少63mol％的含量存在和/或可电离脂质以小于35.5mol％的含量存在。
13、在另一个实施例中，甾醇或其衍生物以至少64mol％的含量存在和/或可电离脂质以小于34.5mol％的含量存在。
14、在又一个实施例中，甾醇或其衍生物以至少65mol％的含量存在和/或可电离脂质以小于33.5mol％的含量存在。
15、在再另一个实施例中，甾醇或其衍生物以至少66mol％的含量存在和/或可电离脂质以小于32.5mol％的含量存在。
16、在一个实施例中，磷脂的含量小于1mol％。在另一个实施例中，磷脂的含量小于0.5mol％。
17、在一个实施例中，亲水性聚合物脂质的含量小于2.5mol％。
18、在一个实施例中，负载物分子是sirna、mrna、载体核酸、反义寡核苷酸、或是核酸-蛋白质或肽复合物。
19、在又一个实施例中，负载物分子是sirna、载体核酸或反义寡核苷酸。
20、在另一个实施例中，可电离脂质是氨基脂质。
21、在再另一个实施例中，甾醇衍生物是非阳离子脂质。
22、在又一个实施例中，脂质纳米颗粒具有通过冷冻电镜(cryo-tem)可见的电子致密核心。
23、在又一个实施例中，脂质纳米颗粒基本上不含中性脂质。
24、在另一个实施例中，甾醇是胆固醇或甾醇衍生物是胆固醇衍生物。
25、在又一个实施例中，脂质纳米颗粒还包括生育酚。例如，生育酚可以0.5至15mol％之间存在。
26、根据本公开的另一个方面，提供了一种用于递送mrna或载体dna以在体内在肝脏中生产蛋白质或肽的方法，该方法包括向哺乳动物施用脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒具有至少45mol％甾醇或其衍生物、中性脂质和可电离脂质，其中所述mrna或载体dna包封在所述脂质纳米颗粒内，并且其中所述脂质纳米颗粒的施用导致由所述mrna或载体dna编码的蛋白质或肽的肝脏特异性表达，其中所述脂质纳米颗粒使肝脏中由所述mrna或载体dna编码的蛋白质或肽的表达比脾脏增加至少20倍。
27、根据另一个方面，提供了一种用于递送sirna或反义寡核苷酸以在体内在肝脏中沉默基因的方法，该方法包括向哺乳动物施用脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒具有至少45mol％甾醇或其衍生物、中性脂质和可电离脂质，其中mrna包封在所述脂质纳米颗粒内，并且其中所述脂质纳米颗粒的施用导致由核酸序列编码的蛋白质或肽的肝脏特异性沉默，其中脂质纳米颗粒使肝脏中核酸的沉默比脾脏增加至少5倍。
28、根据本公开的一个实施例，在肝脏相比于脾脏中的由mrna编码的蛋白质或肽的表达增加比在肝脏相比于脾脏中的onpattro lnp的表达增加大至少10％。
29、根据又一个实施例，中性脂质的含量在0至10mol％之间。在本公开的一个示例中，中性脂质的含量小于8mol％、7mol％、6mol％、5mol％或4mol％。
30、根据另一个实施例，甾醇或其衍生物以45至80mol％存在。
31、根据另一个实施例，甾醇或其衍生物以49至65mol％存在。
32、根据另一个实施例，亲水性聚合物-脂质缀合物以在0.5至3mol％之间的含量存在于脂质纳米颗粒中。
33、根据一个实施例，在上述任何方面和/或实施例中的可电离脂质组分包括可电离阳离子脂质和可电离阴离子脂质的混合物。
1.一种脂质纳米颗粒，其包含：
2.根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒，其中所述甾醇或其衍生物以至少50mol％的含量存在。
3.根据权利要求2所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质以小于48.5mol％的含量存在。
4.根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒，其中所述甾醇或其衍生物以至少52mol％的含量存在。
5.根据权利要求4所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质以小于46.5mol％的含量存在。
6.根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒，其中所述甾醇或其衍生物以至少54mol％的含量存在。
7.根据权利要求6所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质以小于44.5mol％的含量存在。
8.根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒，其中所述甾醇或其衍生物以至少56mol％的含量存在。
9.根据权利要求8所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质以小于42.5mol％的含量存在。
10.根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒，其中所述甾醇或其衍生物以至少58mol％的含量存在。
11.根据权利要求10所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质以小于40.5mol％的含量存在。
12.根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒，其中所述甾醇或其衍生物以至少60mol％的含量存在。
13.根据权利要求12所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质以小于38.5mol％的含量存在。
14.根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒，其中所述甾醇或其衍生物以至少62mol％的含量存在。
15.根据权利要求14所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质以小于36.5mol％的含量存在。
16.根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒，其中所述甾醇或其衍生物以至少63mol％的含量存在。
17.根据权利要求16所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质以小于35.5mol％的含量存在。
18.根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒，其中所述甾醇或其衍生物以至少64mol％的含量存在。
19.根据权利要求18所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质以小于34.5mol％的含量存在。
20.根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒，其中所述甾醇或其衍生物以至少65mol％的含量存在。
21.根据权利要求20所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质以小于33.5mol％的含量存在。
22.根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒，其中所述甾醇或其衍生物以至少66mol％的含量存在。
23.根据权利要求22所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质以小于32.5mol％的含量存在。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述磷脂的含量小于1mol％。
25.根据权利要求1至23中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述磷脂的含量小于0.5mol％。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述亲水性聚合物-脂质的含量小于2.5mol％。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述负载物分子是sirna、mrna、载体核酸、反义寡核苷酸、或是核酸-蛋白质或肽复合物。
28.根据权利要求27所述的脂质纳米颗粒，其中所述负载物分子是sirna、载体核酸或反义寡核苷酸。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述可电离脂质是氨基脂质。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中甾醇衍生物是非阳离子脂质。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒具有通过冷冻电镜可见的电子致密核心。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒基本上不含中性脂质。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述甾醇是胆固醇、或甾醇衍生物是胆固醇衍生物。
34.根据权利要求1至32中任一项所述的脂质纳米颗粒，其进一步包含生育酚。
35.根据权利要求34所述的脂质纳米颗粒，其中所述生育酚以在0.5至15mol％之间的含量存在。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述磷脂以在0.5至3mol％之间的含量存在。
37.根据权利要求36所述的脂质纳米颗粒，其中所述磷脂是磷脂-胆固醇缀合物。
38.根据权利要求37所述的脂质纳米颗粒，其中所述磷脂-胆固醇缀合物是磷脂酰胆碱-胆固醇缀合物。
39.一种用于递送mrna或载体dna以在体内在肝脏中产生蛋白质或肽的方法，所述方法包括向哺乳动物施用脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒具有至少45mol％甾醇或其衍生物、中性脂质和可电离脂质，其中所述mrna或载体dna包封在所述脂质纳米颗粒内，并且其中所述脂质纳米颗粒的施用导致由所述mrna或载体dna编码的蛋白质或肽的肝脏特异性表达，其中所述脂质纳米颗粒使肝脏中由所述mrna或载体dna编码的蛋白质或肽的表达比脾脏增加至少20倍。
40.一种用于递送sirna或反义寡核苷酸以在体内在肝脏中沉默基因的方法，所述方法包括向哺乳动物施用脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒具有至少45mol％甾醇或其衍生物、中性脂质和可电离脂质，其中mrna包封在所述脂质纳米颗粒内，并且其中所述脂质纳米颗粒的施用导致由核酸序列编码的蛋白质或肽的肝脏特异性沉默，其中脂质纳米颗粒使肝脏中核酸的沉默比脾脏增加至少5倍。
41.根据权利要求39所述的方法，其中在其他相同条件下测量的由所述mrna编码的蛋白质或肽的在肝脏相比于脾脏中的表达增加比在onpattro lnp中的在肝脏相比于脾脏中的表达增加大至少10％。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述中性脂质的含量在0.25至10mol％之间。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述中性脂质的含量在0.5至8mol％之间。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述中性脂质的含量小于7mol％。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述中性脂质的含量小于6mol％。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述中性脂质的含量小于5mol％。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述中性脂质的含量小于4mol％。
48.根据权利要求39至47中任一项所述的方法，其中所述甾醇或其衍生物以45至80mol％的含量存在。
49.根据权利要求45所述的方法，其中所述甾醇或其衍生物以49至65mol％的含量存在。
50.根据权利要求39至49中任一项所述的方法，其中亲水性聚合物-脂质缀合物以在0.5至3mol％之间的含量存在于所述脂质纳米颗粒中。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述亲水性聚合物-脂质缀合物以在0.5至2.0mol％之间的含量存在于所述脂质纳米颗粒中。
