本发明属于天然药物制备领域，具体地说，涉及一种土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的制备方法与应用。
背景技术：
1、曲札茋苷又名白皮杉醇-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷，是拉萨大黄药材中的主要二苯乙烯苷类活性成分。曲札茋苷能够抑制血栓形成、保护血管，相对于传统的抗血栓药，曲札茋苷没有胃肠道损伤、出血等副作用。曲札茋苷的结构式如式i中所示：
2、
3、在临床研究期间，研究人员发现土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷是曲札茋苷中含量最高的相关物质，曲札茋苷拟开发为注射剂，因此对相关物质进行精准控制有利于曲札茋苷今后的质量及安全风险控制。
4、孙玉明等在“高效液相色谱法测定曲札茋苷原料药的含量及有关物质”中建立高效液相色谱法测定曲札茋苷的含量及有关物质。其中，有关物质检测用对照品溶液的制备方法为：精密吸取有关物质检测用供试品溶液0.1ml于10ml棕色量瓶中，加超纯水稀释定容至刻度，摇匀。推测杂质2结构为土大黄苷元-3'-o-β-d-葡萄糖苷。而该文章中仅公开采用有关物质检测用供试品溶液配制有关物质检测用对照品溶液，并没有公开有关物质检测用供试品溶液的具体成分、纯度及制备方法等，因此，只能推测检测到的杂质，准确度有待提高；更无法判断杂质含量检测的准确性。
5、目前，关于土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷杂质的制备及含量标定方法未见报道。鉴于该杂质对控制曲札茋苷产品质量至关重要，故该杂质标准品的获得对有效控制曲札茋苷原料及其制剂质量有着重要的意义。
6、有鉴于此特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的制备方法与应用，依次采用乙醇回流提取、大孔树脂分离、脱色树脂脱色的方式得到土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷粗品，再采用中高压制备色谱进行纯化，可以得到高纯度的土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷纯品。本发明的制备方法制备的土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的纯度高，可以作为杂质对照品用于曲札茋苷的质量控制，提高了现有曲札茋苷的药品质量和临床用药安全。另外，制备过程中采用的洗脱体系为乙醇和水，安全无毒，提高了生产的安全性和稳定性。
2、为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
3、本发明的第一目的是提供一种土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的制备方法，包括：
4、(1)提取：向拉萨大黄粗粉中加入乙醇溶液，连续加热回流提取，合并提取液，减压浓缩至无醇，得到提取浓缩液；
5、(2)沉淀：将提取浓缩液加水进行搅拌溶散后静置，过滤；
6、(3)大孔树脂层析：取滤液过大孔树脂层析柱进行分离，采用乙醇-水的洗脱体系进行等度洗脱，收集含土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的洗脱液，将洗脱液减压浓缩至无醇；
7、(4)脱色：将上述浓缩液过脱色树脂层析柱，采用乙醇-水的洗脱体系进行等度洗脱，并收集洗脱液，减压浓缩至无醇；
8、(5)中高压制备色谱纯化：将聚合物填料装入中高压制备色谱系统中，用乙醇-水的体系进行平衡后将(4)中的浓缩液注入中高压制备色谱中，采用乙醇-水的洗脱体系进行洗脱，收集含土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的洗脱液并减压浓缩至无醇；
9、(6)结晶：将(5)中的浓缩液静置结晶，过滤，得土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷纯品。
10、本发明的制备方法，将拉萨大黄原料依次进行乙醇回流提取，水沉淀，大孔树脂纯化、脱色树脂层析脱色，得到土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷粗品，再采用中高压制备色谱纯化，进行结晶，得到高纯度的土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷。所得纯品中土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷含量在98.5％以上，纯度大大提高。本发明采用中高压制备色谱纯化法制备高纯度的土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷，并摸索优化了沉淀、脱色树脂层析柱、中高压制备色谱纯化的条件，既提高了产品纯度，同时还可以提高生产效率。另外，本发明方法的整个过程只使用了安全无毒的溶剂水和乙醇，生产工艺绿色环保，产品质量稳定，为该杂质的制备提供了一种新思路。
11、进一步的方案，步骤(1)中，乙醇溶液的体积用量为拉萨大黄粗粉质量的6～8倍，乙醇溶液的浓度为85～95％；
12、优选的，步骤(1)中，连续加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液。
13、进一步的方案，步骤(2)中，加水量的体积为提取浓缩液体积的1～3倍，静置时间为48～72小时。
14、本发明中提取浓缩液经过沉淀步骤，加水静置的沉淀效果好，静置时间为48～72小时，可以充分水沉，部分脂溶性成分、杂质在静置沉淀中析出，减少其他杂质，有利于纯化。
15、进一步的方案，步骤(3)中，乙醇-水的洗脱体系中，乙醇的洗脱浓度为30～40％，洗脱体积为2～8倍。如此，可以增加土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的收率。
16、进一步的方案，步骤(3)中，脱色树脂层析柱可以采用现有技术中现有的脱色树脂。
17、进一步的方案，步骤(4)中，乙醇-水的洗脱体系中，乙醇的洗脱浓度为80％以上，洗脱体积为1～6倍。
18、进一步的方案，步骤(4)中，大孔吸附树脂包括d101型吸附树脂。
19、进一步的方案，步骤(5)中，所述聚合物填料选自uni ps，uni psa，uni psn，unipmm中的一种，粒径大小为5～70μm，孔隙大小为
20、优选的，所述中高压制备色谱的压力为5～50bar。
21、进一步的方案，步骤(5)中，所述中高压制备色谱纯化中，聚合物填料的体积为拉萨大黄原料重量的8～12倍。
22、例如，聚合物填料单位可以为ml，拉萨大黄原料重量可以为g。或者，聚合物填料单位可以为l，拉萨大黄原料重量可以为kg。
23、由于土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷在拉萨大黄中的含量较低，其他物质含量更高，本发明采用的聚合物填料的体积为拉萨大黄原料重量的8～12倍，如此增加填料用量可增加分离效果。此过程中土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷与曲札茋苷的结构极为相似，增加填料用量可很大程度分离土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷。
24、进一步的方案，步骤(5)中，所述中高压制备色谱纯化中，洗脱程序为：20％～35％乙醇水溶液洗脱，接收第9～12倍柱体积的洗脱液，收集土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷；100％乙醇洗脱9～10倍柱体积进行冲洗，洗脱结束后用20％～35％乙醇水溶液平衡；
25、优选的，上样流速为50～100ml/min；洗脱和平衡线流速为200～400ml/min。
26、进一步的方案，步骤(5)中，所述中高压制备色谱纯化中，设定的波长为319nm。
27、本发明的大孔树脂层析、脱色树脂层析、脱色以及中高压制备色谱纯化中，均采用乙醇-水的体系进行平衡或洗脱，既能够实现很好的洗脱土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷，而且洗脱剂为水醇混合液，成本低，对环境友好。
28、本发明还提供一种如上所述的制备方法制备的土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷作为曲札茋苷的质量控制检测中杂质对照品的应用。
29、本发明还提供一种曲札茋苷的质量控制方法，包括如下步骤：
30、(1)采用如上所述的制备方法制备的土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷制备对照品溶液；制备曲札茋苷标准品溶液；
31、(2)制备曲札茋苷供试品溶液；
32、(3)将对照品溶液、曲札茋苷标准品溶液和曲札茋苷供试品溶液进行高效液相色谱测定；色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以水为流动相b；进行梯度洗脱；流速每分钟1.0ml；检测波长为319nm；柱温30℃；理论板数按土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷峰计算不低于2000；
33、优选的，梯度洗脱条件为：
34、
35、本发明中，土大黄苷元-3'-o-β-d-葡萄糖苷的结构式如下式ii所示：
36、
37、
38、对照品溶液的制备精密称取土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷对照品适量，置于棕色容量瓶中用流动相溶解并稀释配制成每1ml含0.4mg的溶液，即得。
39、采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
40、1、本发明的制备方法依次采用乙醇回流提取、大孔树脂分离、脱色树脂脱色的方式得到土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷粗品，再采用中高压制备色谱进行纯化，可以得到高纯度的土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷纯品，其纯度可以达到98.5％以上，与现有技术相比，纯度大大提高，收率也较高。
41、2、本发明的土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的制备过程中采用的洗脱体系为乙醇和水，安全无毒，提高了生产的安全性和稳定性。聚合物填料处理效率高，且聚合物填料可以重复使用，节约成本，可运用于工业化生产。
42、3、本发明的制备方法制备的土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的纯度高，可以作为杂质对照品用于曲札茋苷的质量控制，提高了现有曲札茋苷的药品质量和临床用药安全。
43、4、本发明提供的曲札茋苷的质量控制方法，以高纯度的土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷作为杂质对照品，采用适宜的高效液相检测条件，不需要考虑校正因子，对曲札茋苷和土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的检测结果准确，有利于提高曲札茋苷的药品质量和临床用药安全。
44、下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
1.一种土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，乙醇溶液的体积用量为拉萨大黄粗粉质量的6～8倍，乙醇溶液的浓度为85～95％；
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，加水量的体积为提取浓缩液体积的1～3倍，静置时间为48～72小时。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，乙醇-水的洗脱体系中，乙醇的洗脱浓度为30～40％，洗脱体积为2～8倍。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，乙醇-水的洗脱体系中，乙醇的洗脱浓度为80％以上，洗脱体积为1～6倍。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述聚合物填料选自uni ps，uni psa，uni psn，uni pmm中的一种，粒径大小为5～70μm，孔隙大小为
7.根据权利要求1-6任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述中高压制备色谱纯化中，聚合物填料的体积为拉萨大黄原料重量的8～12倍。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述中高压制备色谱纯化中，洗脱程序为：20％～35％乙醇水溶液洗脱，接收第9～12倍柱体积的洗脱液，收集土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷；100％乙醇洗脱9～10倍柱体积进行冲洗，洗脱结束后用20％～35％乙醇水溶液平衡；
9.一种如权利要求1-8任意一项所述的制备方法制备的土大黄苷元-3’-o-β-d-吡喃葡萄糖苷作为曲札茋苷的质量控制检测中杂质对照品的应用。
10.一种曲札茋苷的质量控制方法，其特征在于，包括如下步骤：
