本公开涉及一种宫颈癌类器官构建方法及其培养体系，属于类器官培养。
背景技术：
1、宫颈癌的发病率和死亡率在全球女性恶性肿瘤中排名第四，也是我国女性第二大恶性肿瘤，对女性生命健康构成严重威胁。在科学研究中，由于啮齿类小动物宫颈狭小，尚缺乏成熟的原位宫颈肿瘤动物模型，这给宫颈癌研究带来了挑战。
2、目前，宫颈癌研究主要借助于肿瘤细胞系和人源肿瘤组织异种移植(pdx)模型。然而，由于这些细胞系经过长时间的人为传代，存在着在宫颈癌起源等方面的局限性。近年来，随着各种临床前肿瘤模型的不断发展，以类器官(patient-derived organoid，pdo)为代表的体外模型，在探索肿瘤与免疫系统相互作用、临床前抗肿瘤药物的评价、发现免疫治疗的生物标志物等方面表现出良好的应用潜力。
3、类器官(organoid)是在体外三维培养的多功能细胞团，具备自我更新、自我组装以及维持来源组织结构和生理功能的能力，已被证实是高度接近人体器官组织的体外模型。类器官有两大优势：其一，具有来源组织中的主要功能细胞；其二，遗传与表型相对稳定，可长期培养、扩增，并可通过冷冻保存形成生物样本库。2010年，clevers团队利用含有表皮生长因子(egf)、noggin和r-脊椎蛋白(r-spondin)的3d-matrigel培养系统培养小鼠肠道隐窝细胞，形成了类肠组织的隐窝绒毛样复合体，从而开启了类器官研究的新篇章。2011年，sato等人采用类器官技术成功培养出肠腺瘤、barrett上皮组织和结肠癌组织，构建出了来源于肿瘤患者的肿瘤类器官。类器官培养技术于2013年被《science》杂志评选为年度科技发展十大突破之一，并于2017年被《nature methods》杂志评为生命科学领域的年度技术。近年来，以类器官为基础的肿瘤研究不断增加，随着其构建技术的改进及应用方法的开拓，类器官已成为肿瘤学和干细胞生物学研究的重要工具。
4、已知临床妇科肿瘤具有高度的异质性、易耐药、基因变异度高等问题，迫切需要能够稳定维持肿瘤异质性的临床前模型，以进行高通量药物筛选。鉴于类器官模型可保留肿瘤患者组织的病理特征和分子表型，具有异质性和宿主遗传背景的优势，近年来，越来越多的妇科肿瘤研究开始采用类器官进行高通量药物筛查(包括药物敏感性、耐药机制、靶向治疗和免疫治疗等)和机制研究(包括恶性肿瘤的病因及发生发展、恶性肿瘤与宿主周围环境的关系等)。然而，目前针对于宫颈癌类器官的构建及应用研究报道还比较少，宫颈癌类器官构建成功率较低，因此，亟需改进现有构建方法，并对培养体系进行优化，以期为宫颈癌患者耐药测试及相关新药临床前研究提供可靠模型。
技术实现思路
1、本公开提供了一种宫颈癌类器官构建方法及其培养体系，所构建的类器官较好地保留了人体中的宫颈癌组织样本的特点，该培养体系可有效缩短宫颈癌类器官的生长周期，提高构建成功率。为此，本公开提出如下技术方案。
2、本发明提供了一种构建宫颈癌类器官的方法，其包括如下步骤：
3、(i)使用酶系消化液对宫颈癌组织样本进行短时多次消化；
4、(ii)过滤消化后的宫颈癌组织样本，收集滤液以获取细胞和收集剩余组织样本；
5、(iii)对收集的细胞进行类器官培养，以构建宫颈癌类器官。
6、本发明提供了一种构建宫颈癌类器官的方法，其包括如下步骤：
7、(i)使用酶系消化液对宫颈癌组织样本进行短时多次消化；
8、(ii)过滤消化后的宫颈癌组织样本，收集剩余组织样本；
9、(iii)对所收集的剩余组织样本进行悬浮培养，并收集所培养的细胞；
10、(iv)对收集的细胞进行类器官培养，以构建宫颈癌类器官。
11、本发明提供了一种构建宫颈癌类器官的方法，其包括如下步骤：
12、(i)使用酶系消化液对宫颈癌组织样本进行短时多次消化；
13、(ii)过滤消化后的宫颈癌组织样本，收集滤液以获取细胞和收集剩余组织样本；
14、(iii)对所收集的剩余组织样本进行悬浮培养，并收集所培养的来自剩余组织样本的细胞；
15、(iv)混合来自步骤(ii)和(iii)的细胞，并进行类器官培养，以构建宫颈癌类器官。
16、在本发明的方案中，“短时多次”或类似表述是指对宫颈癌组织样本进行多次短时间的酶消化处理，每次消化时间不超过10分钟。示例性地，初次消化时间为1-3分钟/次，逐渐增加至5-7分钟/次，但每次消化时间不超过10分钟。每次消化后通过显微镜观察组织消化状态，以确保消化过程适度并避免细胞损伤。通过这种方法，可以获得两部分细胞：消化滤液中的细胞和剩余组织样本中悬浮培养得到的细胞。这些细胞将混合在一起进行类器官培养，以构建宫颈癌类器官。
17、任选地，在进行酶系消化液对宫颈癌组织样本之前，使用含抗微生素的缓冲溶液对组织样本进行清洗，并将清洗后的组织样本切割成小块。
18、在本发明的实施方案中，酶系消化液中含有胶原酶，其可以是i型、ii型或iv型胶原酶中的任意一个或者其组合，总浓度为1-3mg/ml。
19、进一步地，在本发明的类器官构建过程中，采用短时间多次消化的提取方式可有效减少因消化过度引起的原代细胞活力损伤。这相对于之前现有技术的消化过程能大大降低消化过程所带来的细胞活力损伤。
20、进一步地，在剩余组织样本的悬浮培养过程中，发现组织块中的细胞形成规则的球体。因此，可收集组织块样本，并使用类器官消化液对其进消化，使细胞球碎裂为细胞团块，进而收集所培养的来自剩余组织样本的细胞。
21、在本发明的实施方案中，可以向所收集的细胞中加入适量的基质胶溶液，并栽种于孔板中，固化一定时间后，加入适量宫颈癌类器官培养基进行培养。
22、本发明提供了一种宫颈癌类器官培养基，包括基础培养基、ph调节缓冲液、抗生素、细胞营养补剂，以及调控细胞增殖分化的生长因子和小分子，用于支持原代宫颈癌细胞的生长、增殖和功能维持。
23、进一步地，该培养基的基础成分包括基础培养基advanced dmem/f-12，ph调节缓冲液hepes，抗生素青霉素、链霉素以及primocin。。
24、为了满足宫颈癌细胞的营养需求和生长特性，该培养基还包含了细胞营养补剂，包括l-谷氨酰胺替代物glutamax和b27。
25、生长因子组合包括50-200ng/ml重组人noggin、30-60ng/ml重组人egf、50-150ng/ml重组人fgf10、20-100ng/ml重组人fgf7；所述小分子组合包括250-2000nm a83-01、5-20μm forskolin、5-15μm、sb202190、2.5-15mm尼克酰胺、1-5mm n-乙酰半胱氨酸和5-10μm y-27632。
26、本公开还提供了宫颈癌类器官的构建方法，示例性地，该方法涉及从宫颈癌患者手术标本中采集组织样本，进行细胞分离和培养，以构建宫颈癌类器官模型。本公开还对所构建的宫颈癌类器官进行了功能性评估，以确保类器官的组化和免疫表现与真实的宫颈癌组织一致。这一方法在体外尽可能于模拟了宫颈癌在体内的生长环境，使得类器官的组化和免疫表现与真实的宫颈癌组织一致，为后续的药物研发和治疗方法的探索提供了可靠的实验平台。
27、本公开还提供了宫颈癌类器官的应用，例如宫颈癌类器官在药物筛选、个体化治疗等方面的应用。通过利用该类器官模型，可以进行药物的筛选和评估，验证药物的疗效和安全性；同时，还可以根据患者的个体特征和药物敏感性，开展个体化治疗的研究和实践，为临床治疗提供更加精准和有效的方案。
28、本发明通过精心设计和优化培养基的成分配比，以及生长因子和小分子的添加，使得培养的宫颈癌类器官更加接近于人体内宫颈癌组织的生长和发展过程。这种更佳地模拟和逼真地反映了宫颈癌在体内的特性，为相关疾病的研究提供了更加可靠和有效的实验平台。
29、本发明提供的培养体系有较好的类器官形成率，且采用短时间多次消化的方式代替常规的一次性消化。另外，对提取的原代细胞和剩余组织样本都进行培养，进一步增加了类器官形成率。更进一步地，以本公开中特定生长因子组合和小分子组合两者共同用于调控细胞的增殖、分化和功能表达，模拟宫颈癌在体内的生长和发展过程，获得了更高的类器官形成率，同时获得了与人体宫颈癌在组化和免疫方面非常接近的类器官。
30、本发明所提供的宫颈癌类器官，为研究人员提供了一种有效的工具，用于模拟和研究宫颈癌的生长环境，为相关药物研发和治疗方法的探索提供了重要支持。
1.一种宫颈癌类器官培养基，该培养基包含如下组分：
2.根据权利要求1所述的培养基，其含量如下：
3.权利要求1或2中所定义的生长因子组合和小分子组合两者在构建或培养宫颈癌类器官中的用途。
4.权利要求1或2中所定义的生长因子组合和小分子组合两者在制备用于构建宫颈癌类器官的培养基中的应用。
5.宫颈癌类器官的构建方法，其包括使用权利要求1或2中所定义的培养基。
6.提供了一种构建宫颈癌类器官的方法，其包括如下步骤：
7.一种构建宫颈癌类器官的方法，其包括如下步骤：
8.一种构建宫颈癌类器官的方法，其包括如下步骤：
9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其中所述类器官培养所用的培养基为权利要求1-3中任一项所述的培养基。
10.根据权利要求5-8中任一项所述的方法，其中每次消化时间不超过10分钟，优选从1-3min/次逐渐增加至5-7min/次。
11.根据权利要求5-8中任一项所述的方法，消化体系中的胶原酶是i型、ii型或iv型胶原酶中的任意一个或者其组合，总浓度为1-3mg/ml。
12.一种药物筛选的方法，其包括使待测药物和权利要求5-8中任一项所述方法所构建的类器官接触的步骤。
13.一种评估药物有效性的方法，其包括使所述药物和权利要求5-8中任一项所述方法所构建的类器官接触的步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其还包括检测所述药物是否对所述类器官有抑制或杀灭的活性。
