本发明属于作物基因工程，具体涉及一种crispr/cas9介导的冬瓜基因编辑方法。
背景技术：
1、冬瓜(benincasa hispida cogn.,2n＝2x＝24)是葫芦科重要的蔬菜作物，其果实富含营养物质和代谢产物，可食可药，有益于人类健康。此外，冬瓜具有适应性广、耐贮运、货架期长等特点。冬瓜果实的大小、形状、果皮颜色和蜡粉有无等特征是其重要的农艺性状(xie,d.,xu,y.,wang,j.,et al.,2019.the wax gourd genomes offer insights intothe genetic diversity and ancestral cucurbit karyotype.nat commun,10:5158)。此前，冬瓜的种质创新主要依赖传统的遗传育种。由于冬瓜的遗传基础比较薄弱，常规的育种方法难以创制出具有突破性的材料。随着现代分子生物学技术的快速发展，对冬瓜优异性状的鉴定已逐步提高到分子水平，通过转基因以及基因编辑技术实现育种目标已经成为可能(谢大森,江彪,刘文睿,等.优质、抗病冬瓜多样化育种研究进展[j].广东农业科学,2020,47(11):50-59.)。
2、基因编辑技术主要是利用序列特异性核酸酶在基因位点产生dna双链断裂，借助受体自身的dna修复系统在连接或修复过程中产生随机的插入、删除或替换相应的基因片段，从而实现基因组序列的突变。现有的基因编辑系统主要包括锌指核酸酶(zfns)系统、类转录激活因子效应物核酸酶(talens)系统以及crispr/cas系统(gaj,t.,gersbach,c.a.,barbas,c.f.,2013.zfn,talen,and crispr/cas-based methods for genomeengineering.trends biotechnol,31:397-405.)。其中，crispr/cas系统具有载体构建简单、编辑效率高等优点，已经成为当前主流的基因编辑系统。根据cas基因的数目和功能，可以将crispr/cas系统分为2大类5种类型，其中ⅱ型的crispr/cas9系统是目前最广泛应用的基因编辑的系统(liu,g.,lin,q.,jin,s.,et al.,2022.the crispr-cas toolbox andgene editing technologies.mol cell,82:333-347.)。
3、在植物中，crispr/cas9系统已被应用于编辑基因组和加速作物育种进程。例如，meng等利用crispr/cas9系统在水稻中构建了全基因组的突变体文库(meng,x.,yu,h.,zhang,y.,et al.,2017.construction ofa genome-wide mutant library in riceusing crispr/cas9.mol plant,10:1238-1241.)，为鉴定基因功能和遗传改良奠定了基础。在玉米中，liu等通过编辑cle基因的启动子区域，可以对玉米产量相关性状进行改良(liu,l.,gallagher,j.,arevalo,e.d.,etal.,2021.enhancing grain-yield-relatedtraits by crispr-cas9 promoter editing of maize cle genes.nat plants,7:287-294.)。在番茄中，crispr/cas9系统被用于精准编辑目标基因，从而提高番茄的产量、营养价值和抗逆性等性状(chaudhuri,a.,halder,k.,datta,a.,2022.classification ofcrispr/cas system and its application in tomato breeding.theor appl genet,135:367-387.)。在葫芦科作物中，通过编辑yabby1基因的非翻译区，可以不同程度地提高yabby1的蛋白翻译量，从而实现半矮化或浓密化植株结构(wang,s.,wang,k.,li,z.,etal.,2022.architecture design ofcucurbit crops for enhanced productivity by anatural allele.nat plants,8:1394-1407.)。xin等利用crispr/cas9系统对erecta基因进行编辑，在甜瓜、南瓜和黄瓜中创建出了具有较短节间的紧凑植株(xin,t.,tian,h.,ma,y.,et al.,2022.targeted creating new mutants with compact plant architectureusing crispr/cas9 genome editing by an optimized genetictransformationprocedure in cucurbitplants.hortic res,9:uhab086.)。
4、目前，在冬瓜中以子叶节为外植体，已经建立了完整的离体再生体系(赵芹,谢大森,何晓明等.冬瓜组培再生体系的初步建立[j].热带作物学报,2012,33(04):646-650.；李志芳,闫晋强,韩向峰等.冬瓜离体再生体系的建立.中国蔬菜,2021(04):59-63.)。基于该再生体系，以节瓜(冬瓜变种)子叶节为外植体，建立了稳定的转基因体系(杜翔斐,彭庆务,江彪等.节瓜cqwrky1基因的遗传转化.核农学报,2018,32(06):1060-1069.)。然而，有关冬瓜基因编辑的研究及方法还未见报道。因此，如果能针对冬瓜开发一种crispr/cas9介导的基因编辑方法，可以促进冬瓜的基因编辑研究进展，加速解析目的基因的生物学功能，并为冬瓜品种改良提供理论依据。
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种crispr/cas9介导的冬瓜基因编辑方法，通过构建crispr/cas9介导的冬瓜基因编辑载体，并利用农杆菌介导的冬瓜转基因，从而实现对目的基因的编辑，为后续通过基因编辑研究目的基因的功能，以及加快培育冬瓜新品种提供途径。
2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
3、本发明提供了一种crispr/cas9介导的冬瓜基因编辑方法，该方法包括以下步骤：
4、s1、设计目的基因的靶位点，再克隆目的基因靶位点片段并进行回收，然后将回收的目的基因靶位点片段与经酶切的pgh-rgrf-gif-cr载体连接；
5、s2、将s1的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，经菌落pcr鉴定后测序，对测序正确的菌落进行扩大培养，并提取质粒，得到目的基因-pgh-rgrf-gif-cr重组载体；
6、s3、将s2的目的基因-pgh-rgrf-gif-cr重组载体转化农杆菌感受态细胞，经含利福平和硫酸卡那霉素的培养基抗性筛选后得到含重组载体的农杆菌，将含重组载体的农杆菌培养至od600＝0.6–0.8，并用侵染培养基重悬至od600＝0.2–0.3作为侵染液；所述侵染培养基包括4-5g/l ms培养基、25-35g/l蔗糖和180-220μm乙酰丁香酮；
7、s4、将饱满的冬瓜种子于45-55℃温汤中浸种25-35min，再室温浸泡后剥去种壳，用低浓度naclo溶液摇动浸泡5-10min，消毒后将种子播种于种子培养基上，避光培养至发芽后，切除子叶上部，并将子叶横切成两半，去除生长点及下胚轴，以子叶近端u形末端作为外植体；所述种子培养基包括4-5g/l ms培养基、25-35g/l蔗糖和2-3g/l植物凝胶；
8、s5、通过真空负压法以s3的侵染液对s4的外植体进行侵染，然后将处理好的外植体转移至共培养培养基上，在25℃条件下避光培养3-5d；所述共培养培养基包括4-5g/l ms培养基、25-35g/l蔗糖、2-3g/l植物凝胶、180-220μm乙酰丁香酮、0.4-0.6mg/l 6-苄氨基嘌呤和1-2mg/l脱落酸；
9、s6、将共培养后的外植体转移至芽再生培养基上，在25℃，16h光照/8h黑暗条件下生长4–6周，待不定芽长出后，筛选阳性芽，即得转化成功的再生芽；所述芽再生培养基包括4-5g/lms培养基、25-35g/l蔗糖、2-3g/l植物凝胶、0.4-0.6mg/l 6-苄氨基嘌呤、1-2mg/l脱落酸和280-320mg/l特美汀；
10、s7、切下再生芽，转移至生根培养基中，再对根系发育良好的植株进行驯化，待植株长出新叶后，即可进行正常生长发育；所述生根培养基包括4-5g/lms培养基、25-35g/l蔗糖、2-3g/l植物凝胶、0.01-0.03mg/l 3-吲哚乙酸和280-320mg/l特美汀。
11、优选地，s1中，所述目的基因为bhyab4基因，其编码区的核苷酸序列如seq idno.1所示，所述bhyab4基因的靶位点包括如seq id no.2所示的靶位点1和如seq id no.3所示的靶位点2。
12、优选地，s1中，以pcbc-dt1t2载体为模板，采用如seq id no.4所示的bhyab4-pgh-cr-f和如seq id no.5所示的bhyab4-pgh-cr-r克隆bhyab4基因的靶位点片段并进行回收。
13、优选地，s1中，将回收的目的基因靶位点片段与经asci酶切的pgh-rgrf-gif-cr载体连接。
14、优选地，s4中，冬瓜种子温汤浸种后，再室温浸泡1–3h。由于冬瓜种皮较厚，温汤浸种后，将种子在室温再浸泡1–3h，方便剥去种壳。
15、优选地，s4中，所述低浓度naclo溶液为1％naclo溶液。由于冬瓜种子不耐受酒精，容易造成不发芽，故不使用75％酒精进行消毒，仅使用低浓度naclo溶液(1％)消毒。
16、优选地，s4中，避光培养至发芽的温度为31-33℃。此温度可以更好的促进冬瓜种子发芽。
17、优选地，s6中，共培养后的外植体用无菌水冲洗3–4遍后再转移至芽再生培养基上。这样可以减少外植体上残留的农杆菌。
18、优选地，s6中，在25℃，16h光照/8h黑暗条件下培养超过3周，且不满4周时，将外植体转移至新的芽再生培养基上进行继代培养。这样可以抑制农杆菌的生长。
19、优选地，s7还包括鉴定冬瓜目的基因编辑方式的步骤：以野生型和转化成功冬瓜叶片的dna作为模板，扩增并进行回收包含靶位点的目的基因片段，然后将回收的目的基因片段与peasy-blunt载体连接，将所得连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，经菌落pcr鉴定后进行测序，最后将野生型和转化成功冬瓜的测序结果进行比对，分析靶位点附近的序列变异，当出现序列插入、删除或替换时，表明目的基因被成功编辑。
20、更优选地，当目的基因为bhyab4基因时，采用如seq id no.8所示的bhyab4-id-f和如seq id no.9所示的bhyab4-id-r进行目的基因的扩增和回收；使用如seq id no.10所示的m13-f和如seq id no.11所示的m13-r进行菌落pcr鉴定。
21、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
22、本发明公开了一种crispr/cas9介导的冬瓜基因编辑方法，首先设计冬瓜目的基因的靶位点，并将其构建到crispr/cas9介导的基因编辑载体pgh-rgrf-gif-cr中，得到目的基因-pgh-rgrf-gif-cr重组载体后将重组载体转入农杆菌感受态细胞中，然后通过侵染、共培养、再生等步骤转化冬瓜外植体；最后筛选阳性芽即得到转化成功的冬瓜再生芽。本发明通过构建crispr/cas9介导的冬瓜基因编辑载体，并利用农杆菌介导的转基因，从而实现对目的基因的编辑，为后续通过基因编辑研究目的基因的功能，以及加快培育冬瓜新品种提供途径。总体而言，本发明具有如下优点：
23、(1)本发明构建冬瓜基因编辑载体的方法，具有靶位点设计流程简单，载体构建便捷和快速等优点；
24、(2)本发明优化的冬瓜转基因方法，改进了种子的浸种方式、消毒方法和培养温度，以提高种子发芽率，改进了共培养后和芽再生过程中的操作流程，以抑制农杆菌的生长，并优化了种子培养基、侵染培养基、共培养培养基、芽再生培养基和生根培养基，最终能够促进再生芽的生长，筛选到有荧光的阳性芽；
25、(3)本发明方法能够对冬瓜的目标基因进行编辑，获得目标基因的打靶突变体，可以促进相关基因的功能研究，具有广阔的应用前景。
1.一种crispr/cas9介导的冬瓜基因编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种crispr/cas9介导的冬瓜基因编辑方法，其特征在于，s1中，所述目的基因为bhyab4基因，其编码区的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述bhyab4基因的靶位点包括如seq id no.2所示的靶位点1和如seq id no.3所示的靶位点2。
3.根据权利要求1所述的一种crispr/cas9介导的冬瓜基因编辑方法，其特征在于，s1中，以pcbc-dt1t2载体为模板，采用如seq id no.4所示的bhyab4-pgh-cr-f和如seq idno.5所示的bhyab4-pgh-cr-r克隆bhyab4基因的靶位点片段并进行回收。
4.根据权利要求1所述的一种crispr/cas9介导的冬瓜基因编辑方法，其特征在于，s4中，冬瓜种子温汤浸种后，再室温浸泡1–3h。
5.根据权利要求1所述的一种crispr/cas9介导的冬瓜基因编辑方法，其特征在于，s4中，所述低浓度naclo溶液为1％naclo溶液。
6.根据权利要求1所述的一种crispr/cas9介导的冬瓜基因编辑方法，其特征在于，s4中，避光培养至发芽的温度为31-33℃。
7.根据权利要求1所述的一种crispr/cas9介导的冬瓜基因编辑方法，其特征在于，s6中，共培养后的外植体用无菌水冲洗3–4遍后再转移至芽再生培养基上。
8.根据权利要求1所述的一种crispr/cas9介导的冬瓜基因编辑方法，其特征在于，s6中，在25℃，16h光照/8h黑暗条件下培养超过3周，且不满4周时，将外植体转移至新的芽再生培养基上进行继代培养。
9.根据权利要求1所述的一种crispr/cas9介导的冬瓜基因编辑方法，其特征在于，s7还包括鉴定冬瓜目的基因编辑方式的步骤：以野生型和转化成功冬瓜叶片的dna作为模板，扩增并进行回收包含靶位点的目的基因片段，然后将回收的目的基因片段与peasy-blunt载体连接，将所得连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，经菌落pcr鉴定后进行测序，最后将野生型和转化成功冬瓜的测序结果进行比对，分析靶位点附近的序列变异，当出现序列插入、删除或替换时，表明目的基因被成功编辑。
10.根据权利要求9所述的一种crispr/cas9介导的冬瓜基因编辑方法，其特征在于，当目的基因为bhyab4基因时，采用如seq id no.8所示的bhyab4-id-f和如seq id no.9所示的bhyab4-id-r进行目的基因的扩增和回收；使用如seq id no.10所示的m13-f和如seq idno.11所示的m13-r进行菌落pcr鉴定。
