本发明涉及生物医药，具体涉及一种金银花黄酮脂质体膜及其制备方法和在抗mrsa中的应用。
背景技术：
1、随着广谱抗菌药的广泛使用，细菌耐药率呈逐年升高的趋势，出现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus,mrsa)等多药耐药菌株，给临床抗感染治疗带来巨大挑战。mrsa从发现至今已在全球广泛流行，已成为菌血症、心内膜炎、皮肤和软组织感染、骨和关节感染以及医院获得性感染的主要原因。目前，临床上治疗mrsa感染的首选药物是万古霉素(vancomysin，van)，其次还有利奈唑胺和达托霉素，然而近年来发现van对mrsa的最低抑菌浓度出现向上漂移的现象，并且还发现了对上述抗菌药耐药的分离株。因此，积极探寻新的抗mrsa方法对于临床抗感染治疗意义重大。
2、金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花，中医理论认为其具有清热解毒、宣风散热的功效，是治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、温病发热之要药。现代药理研究表明，金银花具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、调节免疫等多种活性。金银花的药效物质研究显示金银花含有挥发油类、有机酸类、黄酮类、三萜及其皂苷类等活性物质，其中绿原酸和黄酮类化合物是其主要的抗菌活性成分，有研究表明，黄酮类成分的抗菌作用比绿原酸更强。
3、脂质体作为一种新型药物递送系统，因其两亲性对亲水和亲脂药物均有良好的包载能力，并能提高药物的稳定性，还具有良好的生物相容性。然而，液体状态的脂质体存在易聚集合并、药物泄露、使用时易流动而损失的弊端。膜剂作为一种具有良好生物相容性和粘附性的固体制剂，特别适用于皮肤给药，将脂质体负载于膜剂可有效改善其不稳定的弊端。
技术实现思路
1、本发明研究将金银花黄酮(loniceraejaponicae flos flavonoids，lf)制成lf脂质体膜(lf liposome membrane，lflm)，并研究其对mrsa的抗菌作用及机制。基于此，本发明提供了如下技术方案：
2、本发明的第一方面提供了一种金银花黄酮脂质体膜的制备方法，包括如下步骤：以磷脂、胆固醇为载体制备得到金银花黄酮脂质体lfl，然后将所述lfl负载于壳聚糖和聚乙烯醇的混合膜材中制得金银花黄酮脂质体膜lflm。
3、优选地，所述的制备方法，以磷脂、胆固醇为载体，利用有机溶剂注入法制备金银花黄酮脂质体lfl。
4、优选地，所述制备方法包括如下步骤：
5、s1、制备金银花黄酮脂质体lfl
6、取金银花黄酮lf用水溶解得到lf水溶液，取大豆磷脂和胆固醇溶于有机溶剂中混匀，将大豆磷脂和胆固醇的有机溶剂溶液注入lf水溶液中，搅拌挥干有机溶剂后超声破碎，得lf脂质体；所述有机溶剂为乙醇或者乙醚；
7、s2、取聚乙烯醇pva溶水中，加入冰醋酸混匀，加入壳聚糖cs，充分溶解，形成pva-cs溶液，各物质使用量配比比例为：pva:cs:冰醋酸:水为1.5～5g:0.3～1g:0.4～0.6ml:50ml；将lf脂质体、pva-cs溶液和甘油按4-6:3-5:1的体积比混匀后，铺平烘干即得lflm；优选各物质使用量配比比例为：pva:cs:冰醋酸:水为2～3g:0.3～0.7g:0.4～0.6ml:50ml。
8、优选地，所述步骤s1中，lf水溶液的浓度为20-40mg/ml，预热至35-45℃；大豆磷脂和胆固醇的有机溶剂溶液中磷脂浓度为30-40mg/ml，磷脂和胆固醇的质量比为5-20，优选磷脂和胆固醇的质量比为14-16，在搅拌条件下，用注射器缓慢将大豆磷脂和胆固醇的有机溶剂溶液注入lf水溶液中，其中，lf与磷脂的质量比为4-6:1；搅拌挥干有机溶剂后，用超声破碎仪以30-50％超声能量超声8-20min即得lf脂质体。
9、优选地，所述步骤s2中，取聚乙烯醇pva溶于85-95℃热水中，冷却至室温后加入冰醋酸混匀，加入壳聚糖cs，充分溶解，形成pva-cs溶液。
10、优选地，所述步骤s2中，各物质使用量配比比例为：pva:cs:冰醋酸:水为2.5g:0.5g:0.5ml:50ml；lf脂质体、pva-cs溶液和甘油按5:4:1的体积比混匀。
11、本发明的第二方面提供一种金银花黄酮脂质体膜，采用上述任一项所述的制备方法制备得到。
12、本发明的第三方面提供上述的金银花黄酮脂质体膜lflm在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物中的应用。
13、优选地，所述的应用为金银花黄酮脂质体膜lflm与van联用在制备抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mrsa的药物中的应用；
14、优选lflm与van联用时lflm与van的质量比为500-5000:1，进一步优选500-2000:1或者800-1500:1。
15、在上述的应用的技术方案中，lflm或lflm与van联用抑制mrsa的生长、存活和生物膜形成。
16、本发明的有益效果是：
17、本发明以磷脂、胆固醇为载体，利用有机溶剂注入法制备金银花黄酮脂质体(loniceraejaponicae flos flavonoids liposome，lfl)，然后将其负载于壳聚糖和聚乙烯醇的混合膜材中制得lflm，测定lfl粒径、多分散指数(polydispersity index，pdi)和lflm的体外释放率。通过平板法、活死染色评价lflm对mrsa的抗菌活性，结晶紫染色观察lflm对mrsa生物膜形成的影响，微板法测定lflm对mrsa的k+、mg2+、ldh、akp释放的影响，qpcr测定lflm对mrsameca和mecr1 mrna水平的影响，通过分子对接评价金银花黄酮中代表性化合物与pbp2a蛋白的亲和力。
18、本发明制得的lfl粒径为(80.91±3.96)nm，pdi值为(0.26±0.07)；lflm在12h内释放率为55％，36h内释放率为73％；lflm对mrsa的生长、存活和生物膜形成具有显著抑制作用，促进其k+、mg2+、ldh、akp释放，并降低meca和mecr1 mrna水平；分子对接显示lf中的木犀草苷、芦丁、木犀草素、山奈酚、异鼠李素和槲皮素与pbp2a具有良好亲和力。
19、本发明制得的lflm释药特性良好，具有显著的抗mrsa活性，其机制可能与促进细胞壁和细胞膜破坏，抑制耐药蛋白pbp2a及其调控基因表达有关。本发明为皮肤及软组织的mrsa感染提供新的治疗策略。
1.一种金银花黄酮脂质体膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以磷脂、胆固醇为载体制备得到金银花黄酮脂质体lfl，然后将所述lfl负载于壳聚糖和聚乙烯醇的混合膜材中制得金银花黄酮脂质体膜lflm。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：以磷脂、胆固醇为载体，利用有机溶剂注入法制备金银花黄酮脂质体lfl。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，lf水溶液的浓度为20-40mg/ml，预热至35-45℃；大豆磷脂和胆固醇的有机溶剂溶液中磷脂浓度为30-40mg/ml，磷脂和胆固醇的质量比为5-20，优选磷脂和胆固醇的质量比为14-16，在搅拌条件下，用注射器缓慢将大豆磷脂和胆固醇的有机溶剂溶液注入lf水溶液中，其中，lf与磷脂的质量比为4-6:1；搅拌挥干有机溶剂后，用超声破碎仪以30-50％超声能量超声8-20min即得lf脂质体。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中，取聚乙烯醇pva溶于85-95℃热水中，冷却至室温后加入冰醋酸混匀，加入壳聚糖cs，充分溶解，形成pva-cs溶液。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中，各物质使用量配比比例为：pva:cs:冰醋酸:水为2.5g:0.5g:0.5ml:50ml；lf脂质体、pva-cs溶液和甘油按5:4:1的体积比混匀。
7.一种金银花黄酮脂质体膜，其特征在于：采用权利要求1至6任一项所述的制备方法制备得到。
8.权利要求7所述的金银花黄酮脂质体膜lflm在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：金银花黄酮脂质体膜lflm与van联用在制备抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mrsa的药物中的应用；
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：lflm或lflm与van联用抑制mrsa的生长、存活和生物膜形成。
