本发明涉及生物活性材料，特别涉及一种复合水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术：
1、老年人由于骨质疏松的存在，所患骨缺损多为骨质疏松性骨缺损，其伤口周围骨骼的强度下降和愈合能力欠佳，且多为粉碎性骨折，治疗时固定失败或不愈合的概率高，是目前临床治疗中较为棘手的一个难题。老年人的骨缺损的复杂性是多方面的，根源于身体的衰老状态：(1)细胞衰老导致成骨细胞活力下降；(2)多方面原因引起的慢性炎症；(3)衰老导致氧化应激加剧；(4)由于免疫功能减弱，细菌感染的风险增加。
2、衰老过程会导致成骨细胞的增殖和功能显著下降，削弱了骨骼的自然再生过程，还伴随着免疫功能的逐渐退化，降低了老年人对慢性炎症的抵抗力，炎症反应会释放出一系列有害的炎症介质，损害成骨细胞的功能，破坏骨重塑的正常过程，阻碍了骨缺损的愈合。因此，巨噬细胞的适当调节和管理在治疗老年人骨质疏松性骨缺损的过程中也至关重要。抑制促炎m1巨噬细胞的激活可以减少慢性炎症，而增强抗炎m2巨噬细胞的活性可以帮助抑制炎症反应和促进组织修复。此外，过量的活性氧(ros)可诱导骨祖细胞和成熟成骨细胞凋亡，抑制成骨标志物如碱性磷酸酶(alp)、骨钙素(ocn)和runt相关转录因子2(runx2)等，从而破坏骨髓基质干细胞(bmsc)和mc3t3-e1细胞的成骨分化，因此，对于ros的清除也有利于骨缺损的修复。
3、传统的骨缺损治疗手段中，钢板内固定、髓内钉植入、自体骨移植和同种异体骨移植的方法均不适用于骨质疏松性骨缺损。为了治疗骨质疏松性骨缺损，植入性生物活性材料逐渐进入研发人员的视野，其可以调节伤口局部的骨平衡，优化骨修复局部微环境，有利于为骨修复提供有利条件。其中，水凝胶作为药物递送载体展现了巨大潜力。例如，现有技术设计了新型plga-peg-plga热敏水凝胶，由聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)和聚乙二醇(peg)组成，可预防和治疗骨质疏松fri模型中的早期细菌感染；以及纳米复合水凝胶支架chap-paa，由纳米羟基磷灰石(n-hap)、碳酸钠(na2一氧化碳3)和聚丙烯酸(paa)组成，能够有效促进骨质疏松病理环境中的新骨形成。此外，现有技术还开发了一种新型透明质酸水凝胶递送雷奈酸锶，该透明质酸水凝胶的成分包括碳酸钙和透明质酸，有助于恢复破骨细胞和成骨细胞活性之间的平衡。但是这些水凝胶都无法综合解决老年患者骨缺损骨修复所面临的问题，如同时增强成骨细胞功能，减轻局部慢性炎症炎症，优化骨修复微环境，因此，在促进骨缺损的有效愈合方面效果有限。
技术实现思路
1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种复合水凝胶，使用羧甲基壳聚糖(cmcs)作为主要成分，并在其中引入了单宁酸(ta)和mn2+，得到的复合水凝胶能够用于负载药物，有利于促进伤口愈合，有利于构造良好的骨生成环境、抑制骨吸收、提高骨修复效率。
2、本发明的第二方面在于提供一种上述复合水凝胶的制备方法。
3、本发明的第三方面在于提供一种上述复合水凝胶的应用。
4、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
5、本发明的第一方面提供一种复合水凝胶，包括羧甲基壳聚糖、单宁酸和mn2+；所述羧甲基壳聚糖与单宁酸的质量比为(5～30)：1。
6、本发明得到的复合水凝胶是一种ph响应型水凝胶，使用羧甲基壳聚糖(cmcs)作为主要成分，并在其中引入了单宁酸(ta)和mn2+。其中，cmcs是壳聚糖的一种衍生物，其优异的生物相容性及抗菌特性使其能够作为生物活性材料，本发明的复合水凝胶中加入cmcs，有利于构造良好的骨生成环境。
7、羧甲基壳聚糖具体包括如下优点：1、生物相容性；2、促进细胞粘附和增殖：成骨细胞需要附着、增殖以形成新的骨组织；3、调节局部微环境的ph值：在骨生成过程中，局部微环境的ph值对细胞活性和矿物质沉积有重要影响；4、促进矿化：与钙离子结合形成类似于骨组织中的羟基磷灰石结构，促进矿物质沉积和骨组织矿化；5、可调节的降解性：有利于得到与骨组织自然修复速率相匹配的水凝胶，以支持新骨组织的形成和成熟；6、促进血管生成：良好的骨生成环境需要血管生成以提供必要的营养和氧气；7、抗菌性；8、可注射性和自愈合性：有利于植入和修复骨损伤；9、多功能性：与其他成分或药物共同作用进一步促成骨。
8、羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan,cmc)是一种从壳聚糖衍生的生物高分子，具有生物相容性好、生物可降解等优点，常用于药物递送系统、组织工程和水凝胶等领域。然而，cmc本身在实际应用过程中存在长期稳定性较差的问题，特别是在水溶液中容易降解或受到微生物的侵蚀。本发明通过引入单宁酸(tannic acid,ta)和mn2+，可以形成交联结构，有助于提升cmc的长期稳定性，从而提高复合水凝胶的机械强度。单宁酸含有多个酚羟基，可以与mn2+形成稳定的络合物，增强复合水凝胶的交联密度，同时，mn2+作为一种金属离子，可以作为交联剂参与形成金属-配体交联，进一步提高复合水凝胶的稳定性和机械性能。
9、此外，单宁酸(ta)作为一种多酚化合物，可以在多方面改善水凝胶的性能。一方面，ta含有大量的邻苯二酚，可以与羧甲基壳聚糖形成强有力的氢键；另一方面，ta有强大的ros清除力、抗菌和抗炎特性，有助于促进伤口愈合，提升骨修复效率。
10、mn是骨骼的重要组成元素，参与骨组织再生的蛋白质合成。本发明在复合水凝胶中引入mn2+，mn2+具有促骨生成和成骨分化的能力，mn2+还具有潜在的ros清除能力，有利于构造良好的骨生成环境及抑制骨吸收，形成老年患者骨缺损部位所需的骨微环境。
11、因此，本发明得到的复合水凝胶具有抗菌、抗炎的效果，能够构造良好的骨生成环境及抑制骨吸收，有效清除ros，促进伤口愈合，提高骨修复效率，并且能够在骨缺损伤口的特定ph环境下，响应释放所负载的药物，对骨缺损进行有效修复治疗。
12、在本发明的一些实施方式中，所述羧甲基壳聚糖与单宁酸的质量比为(8～25)：1。
13、在本发明的一些实施例中，所述羧甲基壳聚糖与单宁酸的质量比为(10～20)：1。
14、在本发明的一些实施方式中，所述复合水凝胶中mn2+的质量含量为13～19％。
15、在本发明的一些实施例中，所述复合水凝胶中mn2+的质量含量为14～18％。
16、在本发明的一些实施方式中，所述复合水凝胶还负载ampk激动剂。
17、ampk(amp蛋白激酶)是调控能量稳态的重要激酶，参与多种信号传导通路，影响着细胞的各种正常生理活动，包括细胞增殖，自噬和凋亡。ampk激动剂可以通过激活amp蛋白激酶(ampk)及其下有相关通路，促进成骨、诱导成骨分化和抑制骨吸收。
18、在本发明的一些实施例中，所述ampk激动剂包括二甲双胍(met)。
19、二甲双胍(met)是一种ampk激动剂，除了可以激活ampk，通过ampk调控成骨与破骨之外，还能够通过靶向与衰老相关的关键分子作用，延缓衰老或缓解衰老相关疾病，具有抗衰老效果，抑制衰老对骨修复的逆向作用。因此，met还可以预防与年龄有关的骨量丢失，恢复自噬通量，促进成骨，结合met的抗衰老作用与促成骨活性，可以同时应对抗衰老、清除ros、抗菌、抑制骨吸收、促进成骨这几大问题。
20、在本发明的一些实施方式中，所述ampk激动剂在所述复合水凝胶中的含量为5～20mg/ml。
21、在本发明的一些实施例中，所述ampk激动剂在所述复合水凝胶中的含量为5～15mg/ml。
22、在本发明的一些具体实施例中，ampk激动剂在所述复合水凝胶中的含量为8～12mg/ml。
23、本发明的第二方面提供一种本发明第一方面所述的复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
24、将单宁酸溶液与羧甲基壳聚糖混合得到cmcs/ta溶液，静置，形成cmcs/ta水凝胶；
25、将所述cmcs/ta水凝胶浸泡在锰盐溶液中，静置，得到所述复合水凝胶。
26、需要说明的是，所述单宁酸溶液为单宁酸水溶液。
27、在本发明的一些实施方式中，所述单宁酸溶液与羧甲基壳聚糖混合的过程包括如下步骤：
28、将羧甲基壳聚糖加入单宁酸溶液中，在室温下搅拌均匀。
29、在本发明的一些实施方式中，所述制备方法还包括负载ampk激动剂的步骤，具体如下：
30、将所述cmcs/ta溶液与ampk激动剂的酸盐混合，再静置，形成负载ampk激动剂的cmcs/ta水凝胶。
31、在本发明的一些实施例中，所述ampk激动剂的酸盐为盐酸盐。
32、在本发明的一些具体实施例中，所述ampk激动剂的酸盐包括盐酸二甲双胍。
33、在本发明的一些实施方式中，所述cmcs/ta水凝胶浸泡在锰盐溶液中后，静置100～140min。
34、在本发明的一些实施方式中，所述单宁酸溶液的质量浓度为0.5～2％。
35、在本发明的一些实施例中，所述单宁酸溶液的质量浓度为0.5～1.5％。
36、在本发明的一些实施方式中，所述羧甲基壳聚糖在所述单宁酸溶液中的质量浓度为10～20％。
37、在本发明的一些实施例中，所述羧甲基壳聚糖子在所述单宁酸溶液中的质量浓度为12～17％。
38、在本发明的一些实施方式中，所述锰盐溶液的质量浓度为0.2～2％。
39、在本发明的一些实施例中，所述锰盐溶液的质量浓度为0.3～1.5％。
40、在本发明的一些具体实施例中，所述锰盐溶液的质量浓度为0.4～1.2％。
41、在本发明的一些实施例中，所述锰盐包括氯化锰、硝酸锰、硫酸锰中的至少一种。
42、在本发明的一些实施方式中，所述锰盐作为形成复合水凝胶的交联剂。
43、在形成cmcs/ta水凝胶之后，将cmcs/ta水凝胶在锰盐溶液中进行浸泡，用锰离子作为交联剂，在水凝胶内部进一步交联，使水凝胶结构变得更加致密，机械强度得到提升。
44、在本发明的一些实施方式中，在形成cmcs/ta水凝胶之前，将所述单宁酸溶液的ph调至中性。
45、在本发明的一些实施例中，所述单宁酸溶液的ph通过naoh调至中性。
46、将ph调至中性，能够为后续锰离子的交联创造合适条件。酸性条件下，锰离子与羧甲基壳聚糖的配位反应不容易发生。
47、本发明的第三方面提供一种本发明第一方面所述复合水凝胶或本发明第二方面所述制备方法得到的复合水凝胶在制备治疗骨缺损的生物活性材料中的应用。
48、在本发明的一些实施方式中，所述生物活性材料用于骨缺损内固定术的联合辅助治疗。
49、在本发明的一些实施方式中，所述生物活性材料ph响应释放药物，所述ph响应范围为5～8。
50、主要是利用单宁酸的特性响应酸性环境。这一特性可能是由于在酸性环境中，单宁酸中大量的酚羟基更容易质子化，形成稳定的酚羟基阳离子。这种质子化增强了单宁酸分子间的离子键，从而可能导致水凝胶网络的松弛和孔隙结构的增加，使得药物更容易通过水凝胶网络释放出来。感应周围环境的ph变化实现药物的可控释放，有助于减少副作用，提高骨修复效率。
51、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
52、(1)本发明采用单宁酸和mn2+改善羧甲基壳聚糖水凝胶的网络结构与机械强度，得到了具有抗菌性、抗氧化性的ph响应型的复合水凝胶，能够构造良好的骨生成环境及抑制骨吸收，有效清除ros，促进伤口愈合，提高骨修复效率，并且能够在骨缺损伤口的特定ph环境下，响应释放所负载的药物，综合解决老年患者骨缺损的各方面难题，例如活性氧(ros)过量、炎症反应、破骨细胞相对活跃等问题。
53、(2)本发明的复合水凝胶通过进一步负载ampk激动剂，可以通过激活amp蛋白激酶(ampk)及其下有相关通路，促进成骨、诱导成骨分化和抑制骨吸收，对骨缺损进行修复治疗。
54、(3)本发明的复合水凝胶适用于制备生物活性材料，用于骨缺损内固定术的联合辅助治疗。
1.一种复合水凝胶，其特征在于，包括羧甲基壳聚糖、单宁酸和mn2+；所述羧甲基壳聚糖与单宁酸的质量比为(5～30)：1。
2.根据权利要求1所述的复合水凝胶，其特征在于，所述复合水凝胶中mn2+的质量含量为13～19％。
3.根据权利要求1或2所述的复合水凝胶，其特征在于，所述复合水凝胶还负载ampk激动剂。
4.根据权利要求3所述的复合水凝胶，其特征在于，所述ampk激动剂在所述复合水凝胶中的含量为5～20mg/ml。
5.一种权利要求1～4任一项所述的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括负载ampk激动剂的步骤，具体如下：
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述单宁酸溶液的质量浓度为0.5～2％；
8.根据权利要求5～7任一项所述的制备方法，其特征在于，在形成cmcs/ta水凝胶之前，将所述单宁酸溶液的ph调至中性。
9.一种权利要求1～4任一项所述复合水凝胶或权利要求5～8任一项所述制备方法得到的复合水凝胶在制备治疗骨缺损的生物活性材料中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述生物活性材料ph响应释放药物，所述ph响应范围为5～8。
