本发明涉及一种外泌体-多巴胺共轭复合物、以及含有该复合物的凝胶贴片及其制备方法和用途。
背景技术：
1、糖尿病周围神经损伤(dpi)糖尿病性周围神经病变(diabetic peripheralneuropathy,dpn)是糖尿病患者常见的并发症之一。严格控制血糖水平是治疗dpi的首要和基础治疗措施。良好的血糖控制可以减缓dpn的进展。药物治疗方面，包括营养神经药物：如甲钴胺，可以促进神经修复，改善神经传导速度；抗氧化应激药物：例如α-硫辛酸，通过清除自由基，保护神经细胞；醛糖还原酶抑制剂：如依帕司他，减少多元醇通路的异常激活，改善代谢紊乱；改善微循环药物：例如己酮可可碱和胰激肽原酶，通过改善血液循环来缓解症状；止痛药物：对于痛性dpi，使用抗惊厥药(如普瑞巴林、加巴喷丁)、抗抑郁药(如度洛西汀、阿米替林)、阿片类药物(如曲马多)等。
2、糖尿病性周围神经病变的治疗确实面临一些挑战和困难，主要包括以下几点：
3、发病机制复杂：dpi的发病机制涉及多元醇通路激活、氧化应激、微循环障碍等多种机制，这使得单一的治疗手段难以全面解决问题。症状多样：dpi的症状包括疼痛、麻木、感觉异常等，不同患者的临床表现差异较大，需要个性化的治疗方案。
4、治疗药物有限：目前针对dpi的治疗药物主要包括营养神经药物、抗氧化应激药物、抑制醛糖还原酶活性药物等，但这些药物往往只能缓解症状，难以根治。
5、疾病进展难以逆转：dpi一旦发生，目前尚无药物能够逆转周围神经病变的进展。
6、患者自我管理困难：dpi的治疗需要患者进行长期的自我管理，包括血糖控制、生活方式改变等，这对患者的依从性提出了较高要求。并发症风险：dpn可能引发多种并发症，如糖尿病足、无痛性心梗等，这些并发症的治疗增加了治疗的复杂性。
7、外泌体由于具有细胞间的通讯功能以及多种生物学特性，可以通过多种途径来干预疾病的发生发展，在周围神经损伤疾病治疗中具有巨大潜力(袁一鸣，等，外泌体在周围神经损伤进程中的效应，《中国组织工程研究》，2020，24(31):5079-5084.doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2093。专利申请号：202211407752.0，发明名称：一种干细胞外泌体在制备周围神经机械性损伤药物中的应用以及含有干细胞外泌体的药物，提供了一种干细胞外泌体在制备周围神经机械性损伤药物中的应用以及含有干细胞外泌体的药物。本发明所用的干细胞具有来源丰富、取材容易以及增殖和分化能力强的特点，可用于“无细胞化”治疗。可以选择局部或/和全身应用干细胞来源外泌体治疗周围神经损伤。申请号202211226700.3，发明名称：一种用于修复缺血/再灌注神经损伤的骨髓间充质干细胞来源的外泌体的提取方法及其应用，涉及一种用于修复缺血/再灌注神经损伤的骨髓间充质干细胞来源的外泌体的提取方法及其应用。证明来自骨髓间充质干细胞来源的外泌体能有效抑制神经细胞凋亡以起到保护神经细胞的作用。
8、赵淑梅，等，神经干细胞外泌体—神经疾病治疗的新途径，中国细胞生物学学报，doi:10.11844/cjcb.2020.08.0013，公开发神经干细胞(neural stemcells,nscs)分泌的外泌体可参与神经性疾病生理和病理的变化过程,并发挥其潜在的神经调节和修复功能。nscs分泌的外泌体可以起到治疗神经系统疾病的作用。
9、甲基丙烯酸多巴胺(dopamine methacrylamide,dma)是一种将多巴胺的生物活性与甲基丙烯酸的化学活性结合的化合物。dma可以与透明质酸共价交联形成水凝胶，这种水凝胶作为干细胞在皮肤再生治疗中的有效载体，能够促进体外细胞增殖和体内皮肤缺损再生，参与构建的多功能水凝胶敷料具有广谱光动力抗菌能力，可以抑制细菌聚集并产生更多的单线态氧，同时具有优异的生物降解性和生物相容性，有利于伤口愈合。dma参与设计的高韧性聚多巴胺-聚丙烯酰胺(pda-pam)水凝胶具有卓越的自我修复能力，这对于组织工程和再生医学应用非常有利。
10、目前尚无将甲基丙烯酸多巴胺与骨髓间充质干细胞(bmscs)来源外泌体复合的相关文献报道。
技术实现思路
1、本发明的技术方案是提供了一种外泌体-多巴胺共轭复合物。本发明还提供了含有该复合物的凝胶贴片及其制备方法和用途。
2、本发明提供了一种外泌体-多巴胺共轭复合物，它是由甲基丙烯酸多巴胺、外泌体为原料制备而成，其摩尔比为：甲基丙烯酸多巴胺：外泌体
3、＝1：1-5；其中，外泌体来源于骨髓间充质干细胞。
4、进一步优选地，所述的甲基丙烯酸多巴胺、外泌体的摩尔比为：1：1。
5、其中，所述的外泌体是从大鼠的骨髓间充质干细胞，经细胞培养后，收集外泌体，采用超速离心法提取外泌体；
6、所述的甲基丙烯酸多巴胺的制备方法为：将碳酸氢钠、硼酸钠溶解到去离子水中；在氮气的保护下，向其中加入多巴胺，搅拌溶解；将甲基丙烯酸酐溶于的四氢呋喃中，并加入到上述反应液中；调节ph至8，搅拌过夜反应；反应结束后，通过用稀盐酸将整个反应体系的ph值调至酸性、乙酸乙酯萃取、正己烷重结晶和真空干燥纯化得到甲基丙烯酸多巴胺固体；
7、优选地，所述的超速离心条件步骤为：
8、a、将骨髓间充质干细胞经培养后得到的培养基以300×g、2000×g、10000×g，分别依次离心10分钟、20分钟、30分钟；
9、b、将上清离心100,000×g离心90分钟，分离出外泌体；
10、c、用pbs洗涤外泌体，以100,000×g离心90分钟；最后，收集外泌体，用50ul pbs重悬备用。
11、本发明提供了所述的外泌体-多巴胺共轭复合物的制备方法，它包括如下步骤：
12、a、称取各摩尔比的原料；
13、b、搅拌均匀，使甲基丙烯酸多巴胺充分与外泌体表面的巯基反应，即得。
14、本发明提供了一种凝胶贴片，它含有所述的外泌体-多巴胺共轭复合物。
15、它是由外泌体-多巴胺共轭复合物、醛基/苯硼酸双官能团化葡聚糖、甲基丙烯酸化明胶为原料制备而成，其重量配比为：
16、外泌体-多巴胺共轭复合物1份、醛基/苯硼酸双官能团化葡聚糖20份、甲基丙烯酸化明胶20-60份；
17、优选地，重量配比为：
18、外泌体-多巴胺共轭复合物1份、醛基/苯硼酸双官能团化葡聚糖20份、甲基丙烯酸化明胶60份。
19、其中，所述的醛基/苯硼酸双官能团化葡聚糖的制备方法为：
20、a、制备氧化葡聚糖：制备分别取葡聚糖溶解到去离子水中，高碘酸钠溶解到去离子水中；将上述两种溶液混合，并在室温条件下搅拌；再将乙二醇加入该混合溶液，反应搅拌结束反应，将反应液透析，冻干后得到氧化葡聚糖；
21、b、将氧化葡聚糖、3-氨基苯硼酸分别溶解于pbs溶液中，然后依次加入到烧瓶中，室温条件下搅拌反应；得到反应液并透析，冻干后得到醛基/苯硼酸双官能团化葡聚糖；
22、所述的甲基丙烯酸化明胶的制备方法为：
23、将明胶加入到pbs(200ml，ph＝7.4)溶液中，并在70℃条件下搅拌溶解；溶解完全后，向其中缓慢滴加甲基丙烯酸酐；50℃下搅拌反应2h后，向其中加入pbs溶液进行稀释；最后，在50℃下透析72h，冻干后得到甲基丙烯酸明胶(gm)。
24、本发明提供了所述的凝胶贴片的制备方法，它包括如下步骤：
25、a、将i2959加入到磷酸盐缓冲盐水(pbs)中，制备含有1％ i2959的溶液；再将甲基丙烯酸化明胶溶解到i2959溶液中；
26、b、醛基/苯硼酸双官能团化葡聚糖溶解到磷酸盐缓冲盐水(pbs)中；
27、c、将exo-dma与醛基/苯硼酸双官能团化葡聚糖溶液等体积混合，混合均匀；将该混合溶液与甲基丙烯酸化明胶溶液按体积比1：1的比例混合，37℃孵育20min，然后注入到模具中，通过光交联形成水凝胶；脱掉磨具，得到凝胶贴片。
28、本发明还提供了所述的凝胶贴片在制备神经保护作用的外用药物或皮下植入药剂中的用途。
29、其中，所述的药物是治疗糖尿病周围神经病变、轴突再生受损、神经传导速度减慢、糖尿病神经形态学改变、糖尿病自主神经功能障碍的药物。
30、本发明的有益效果是：
31、(1)采用超速离心法提取大鼠骨髓间充质干细胞来源外泌体，基于外泌体表面巯基与甲基丙烯酸多巴胺间迈克尔加成反应，构建具有线粒体靶向作用的多巴胺共轭修饰外泌体(exo-dma)。
32、(2)合成苯硼酸/醛基双官能化葡聚糖(odb)与甲基丙烯酰胺化明胶(gm)，通过动态亚胺键与硼酯键交联制备生物活性仿生水凝胶。基于双动态网络，特别是动态硼酯键，赋予凝胶体系柔性力学、自愈合、自粘附、ros清除等性能基础。进一步，通过生物活性凝胶与exo-dma间硼酸酯动态共价键合，制备具有病理微环境重塑与线粒体功能障碍靶向调控作用的外泌体共轭负载凝胶贴片。
33、(3)建立糖尿病大鼠周围神经损伤动物模型，通过凝胶贴片环绕损伤神经自粘结形成管状结构，考察凝胶贴片对糖尿病性pni的神经保护和神经治疗效应。结果表明，基于微环境重塑与线粒体功能障碍靶向调控，外泌体共轭负载凝胶贴片能够有效促进糖尿病性pni大鼠轴突再生、髓鞘形成和运动功能恢复。
34、本发明将来源于骨髓间充质干细胞的外泌体与甲基丙烯酸多巴胺联合使用，以共轭复合物形式，发挥协同作用，制备成的凝胶贴片能够有效促进糖尿病性轴突再生、髓鞘形成和运动功能恢复。
1.一种外泌体-多巴胺共轭复合物，其特征在于：它是由甲基丙烯酸多巴胺、外泌体为原料制备而成，其摩尔比为：甲基丙烯酸多巴胺：外泌体＝1：1-5；其中，外泌体来源于骨髓间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的外泌体-多巴胺共轭复合物，其特征在于：所述的甲基丙烯酸多巴胺、外泌体的摩尔比为：1：1。
3.根据权利要求1或2所述的外泌体-多巴胺共轭复合物，其特征在于：所述的外泌体是从大鼠的骨髓间充质干细胞，经细胞培养后，收集外泌体，采用超速离心法提取外泌体；
4.一种权利要求1-3任一项所述的外泌体-多巴胺共轭复合物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
5.一种凝胶贴片，其特征在于：它含有权利要求1-3任意一项所述的外泌体-多巴胺共轭复合物。
6.根据权利要求5所述的凝胶贴片，其特征在于：它是由外泌体-多巴胺共轭复合物、醛基/苯硼酸双官能团化葡聚糖、甲基丙烯酸化明胶为原料制备而成，其重量配比为：
7.根据权利要求6所述的凝胶贴片，其特征在于：
8.权利要求6或7所述的凝胶贴片的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
9.权利要求5-7任意一项所述的凝胶贴片在制备神经保护作用的外用药物或皮下植入药剂中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述的药物是治疗糖尿病周围神经病变、轴突再生受损、神经传导速度减慢、糖尿病神经形态学改变、糖尿病自主神经功能障碍的药物。
