本发明涉及中药材有效成分提取，尤其涉及一种响应面法优化龙珠中睡茄交酯的超声辅助提取工艺。
背景技术：
1、
2、龙珠tubocapsicum anomalum为茄科solanaceae龙珠属草本植物。《中国中药志要》中记载，龙珠全草入药，用于治疗水肿，疔疮，疮疡肿毒，淋证。根用于痢疾；果实清热解毒，用于恶疮，疖肿(中国药材公司.中国中药资源志要[m].北京：科学出版社,1994,1129.)。睡茄交酯(withanolide)类化合物是龙珠植物中含有的主要化学成分类型，其中化合物tubocapsenolide a和tubocapsanolide a在龙珠中含量较大。目前对龙珠及其主要成分的药理作用研究及药理作用机制的研究极少，仅有少数几篇报道其富含睡茄交酯以及其苷类化合物(kiyota n,shingu k,yamaguchi k,yoshitake y,harano k,yoshimitsu h,miyashita h,ikeda t,tagawa c,nohara t.new c28steroidal glycosides fromtubocapsicum anomalum[j].chemical&pharmaceutical bulletin,2008,56:1038-1040.；kiyota n,shingu k,yamaguchi k,yoshitake y,harano k,yoshimitsu h,ikeda t,nohara t.new c28steroidal glycosides from tubocapsicum anomalum[j].chemical&pharmaceutical bulletin,2007,55:34-36.)，并且通过体外细胞实验证明从龙珠植物中分离得到的睡茄交酯类化合物对肿瘤细胞具有细胞毒活性(hsieh p w,huang z y,chenjh,chang f r,wu c c,yang y l,chiang m y,yen m h,chen s l,yen s h,lubken t,hung w c,wu y c.cytotoxic withanolides from tubocapsicum anomalum[j].journalof natural products,2007,70:747-753.；wang s b,zhu d r,nie b,li j,zhang y j,kong l y,luo j g.cytotoxic withanolides from the aerial parts of tubocapsicumanomalum[j].bioorganic chemistry,2018,81:396-404.)，化合物tubocapsanolide a通过抑制skp2的表达发挥抗肺癌细胞增殖作用(chang h c,chang f r,wang y c,pan m r,hung w c,wu y c.abioactive withanolide tubocapsanolide ainhibitsproliferation ofhuman lung cancer cells via repressing skp2expression[j].molecular cancer therapeutics,2007,6(5):1572-1578.)，以及龙珠中分离得到的anomanolide c通过泛素化gpx4诱导三阴性乳腺癌细胞发生自噬依赖性铁死亡，进而抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖和转移(chen y m,xu w,liu y,et al.anomanolide csuppresses tumor progression and metastasis by ubiquitinating gpx4-drivenautophagy-dependent ferroptosis in triple negative breast cancer[j].international journal of biological sciences,2023,19(8):2531-2550.)。
3、龙珠作为一种药用植物资源，在我国分布广泛并且睡茄交酯类化合物含量丰富，因此对龙珠中睡茄交酯类化合物的高效提取具有重要的研究意义。目前文献中有关睡茄交酯类化合物的提取方法包括加压溶剂萃取法、索氏提取法、微波辅助提取法、超声波提取法和超临界提取等(khan w,bakht j,nair m g,et al.extraction and isolation ofimportant bioactive compounds from the fruit of physalis ixocarpa[j].pakistanjournal of pharmaceutical sciences,2018,31(6):2463-2469.；jyothi d,khanam s,sultana r.optimization of microwave assisted extraction of withanolides fromroots of ashwagandha and its comparison with conventional extraction method[j].international journal of pharmacy and pharmaceutical sciences,2010,2(4):46-50.)。超声波以其独特的空化效应和机械效应增强提取传质过程，可以有效提高提取率，缩短提取时间，节约成本，提高产品质量和收率。超声波提取法是近年来应用到中草药有效成分提取的一种新的较为成熟的技术。响应曲面法(rsm)是一种基于多因素多水平和数学建模的提取条件优化法，较正交试验法简便，较均匀设计法更为准确、迅速。目前，关于采用box-behnken试验法优化龙珠睡茄交酯提取工艺的文献报道较少，故本发明提供了一种采用响应曲面实验优化睡茄交酯提取工艺。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种响应面法优化龙珠中睡茄交酯的超声提取工艺。
2、本发明是通过采用以下技术方案实现的：
3、本发明所述的一种响应面法优化龙珠睡茄交酯的超声提取工艺，包括如下步骤：
4、(1)称取干燥的龙珠果实、叶子、根和/或茎，粉碎过筛，得龙珠粗粉；
5、(2)在龙珠粗粉中加入提取溶剂对龙珠中睡茄交酯进行超声提取；
6、(3)以步骤(2)中提取溶剂种类、提取溶剂浓度、超声时间、超声温度、超声功率和料液比为影响因素对龙珠粉末进行多个单因素提取试验，以提取率最大作为判断标准，根据单因素试验得到各因素对龙珠中睡茄交酯的提取率的影响；
7、(4)在单因素试验的基础上，选择超声时间、超声温度和超声功率作为考察因素，以龙珠中睡茄交酯提取率作为响应值，采用design expert13软件中的box-behnken原理在步骤(3)中单因素实验的基础上进行响应面实验，模拟得到二次多元回归方程如下：
8、yte-a＝-2.2+1.9×10-2x1-3.8×10-2x2+7.4×10-2x3+2.0×10-7x1x2+6.9×10-4x2x3-1.4×10-4x1x3-2.4×10-5x12+7.7×10-5x22-6.9×10-4x32
9、yta-a＝-6.1+1.3×10-2x1-3.4×10-2x2+3.5×10-2x3+6.1×10-7x1x2+4.3×10-4x2x-1.8×10-4x1x33-3.1×10-5x12+3.2×10-5x22-9.1×10-4x32
10、其中，yte-a、yte-a为提取率，x1为超声功率，x2为超声时间，x3为超声温度；
11、通过design expert13软件对回归方程的求解，得到龙珠中睡茄交酯的最佳提取工艺条件。
12、上述一种响应面法优化龙珠睡茄交酯的超声提取工艺，其中：
13、所述步骤(3)中，所述影响因素水平范围为：提取溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯，料液比1:10-1:40，提取溶剂浓度40％-90％(v/v)，超声时间10-60min，超声温度20-60℃。
14、优选的，所述步骤(3)中，所述提取溶剂为乙醇，料液比1:5-1:30，超声温度40-60℃，超声时间10-50min，超声功率50w-250w。
15、进一步优选，所述步骤(3)中，所述乙醇体积浓度为70％，料液比1:20，超声温度50℃，超声时间40min，超声功率250w。
16、所述步骤(4)中，yte-a是龙珠中睡茄交酯tubocapsenolide a的提取率，yte-a是龙珠中睡茄交酯tubocapsanolide a的提取率。
17、本发明采用高效液相色谱检测睡茄交酯提取率。首先以福建产龙珠药材为原料，采用超声波辅助对龙珠根、茎、叶子、果实中的睡茄交酯类化合物进行提取，并采用hplc来对睡茄交酯类化合物进行分析检测。
18、为了进一步优化龙珠中睡茄交酯的高效提取工艺，选取了龙珠植物的干燥茎作为研究材料，并选择了龙珠中具有代表性和较高生物活性的两个化合物tubocapsenolide a(te-a)和tubocapsanolide a(ta-a)，作为hplc定量分析的对照品，以计算龙珠中睡茄交酯类化合物的提取率。
19、本发明所使用的睡茄交酯标准品tubocapsenolide a(te-a)和tubocapsanolidea(ta-a)由本课题组从龙珠(tubocapsicum anomalum)中提取分离得到，为白色晶体(meoh)，核磁数据与文献(journal of natural products,2007,70:747-753)对照一致，确定其结构，纯度>98％。本发明通篇所述的te-a和ta-a具有如下的结构式：
20、
21、本发明所述的响应面法优化龙珠睡茄交酯提取工艺及睡茄交酯类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
22、本发明还公开了龙珠睡茄交酯tubocapsenolide a(te-a)和tubocapsanolide a(ta-a)体外可对肿瘤细胞产生生长抑制作用。
23、由上述可知，龙珠睡茄交酯可以应用于抗肿瘤药物的制备。基于此，本发明还提供了一种组合物，其可以包含由上述的方法所制备的龙珠睡茄交酯和/或药学上可接受的赋形剂。
24、在本发明的一种优选实施方式中，上述的组合物可以配制为散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、滴丸剂、肠溶剂、注射剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂或酊剂中的任意一种剂型。
25、本发明具有以下优点：
26、1)本发明提取工艺提取所得龙珠中睡茄交酯的提取率高。本发明采用响应面法实验，结果最佳提取工艺为：液料比为20:1，提取溶剂为体积浓度70％乙醇，超声功率250w，超声时间40min，超声温度50℃，在该条件下te-a和ta-a的平均得率可以达到2.87±0.12mg/g和1.18±0.05mg/g，响应预测值与实际的实验值基本一致。
27、2)本发明提取工艺操作简单易行且稳定。通过利用响应面优化法所得二次回归方程的拟合值f-values值分别为35.63，15.71，p<0.0001，说明模型具有高度显著性，方程对实验结果拟合良好，实验误差小；拟合度r2为0.9786和0.9528，表明拟合方程与数据的配合度极好。变异系数(cv)分别为2.19％，2.82％，表明该模型的拟合度较好，证明该方程可用于超声辅助提取睡茄交酯的工艺过程分析。
1.一种响应面法优化龙珠中睡茄交酯的超声辅助提取工艺，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种响应面法优化龙珠中睡茄交酯的超声辅助提取工艺，其特征在于，所述步骤(3)中，所述影响因素水平范围为：提取溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯，料液比1:10-1:40，提取溶剂浓度40％-90％，超声时间10-60min，超声温度20-60℃，超声功率50-250w。
3.根据权利要求2所述的一种响应面法优化龙珠中睡茄交酯的超声辅助提取工艺，其特征在于，所述步骤(3)中，所述提取溶剂为乙醇，乙醇体积浓度为70％，料液比1:5-1:30。
4.根据权利要求3所述的一种响应面法优化龙珠中睡茄交酯的超声辅助提取工艺，其特征在于，所述步骤(3)中，料液比1:20，超声温度40-60℃，超声时间10-50min，超声功率250w。
5.根据权利要求4所述的一种响应面法优化龙珠中睡茄交酯的超声辅助提取工艺，其特征在于，所述步骤(3)中，超声温度50℃，超声时间40min。
6.根据权利要求1所述的一种响应面法优化龙珠中睡茄交酯的超声辅助提取工艺，其特征在于，所述步骤(4)中，yte-a是龙珠中睡茄交酯tubocapsenolide a的提取率，yte-a是龙珠中睡茄交酯tubocapsanolide a的提取率。
7.龙珠中睡茄交酯tubocapsenolide a和tubocapsanolide a在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.一种药物组合物，其特征在于，包含龙珠中睡茄交酯tubocapsenolide a和tubocapsanolide a以及药学上可接受的赋形剂，所述药物组合物剂型为散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、滴丸剂、肠溶剂、注射剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂或酊剂。
9.权利要求8所述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
