本技术涉及基因组编辑，尤其是涉及一种东方伊萨酵母crispr/cas9基因编辑系统及其应用。
背景技术：
1、微生物基因组改造主要依赖于内源性同源重组修复(endogenoushomologydirected repair,hdr)和非同源性末端连接(non-homologousendjoining,nhej)两种生物学机制。hdr的基本过程为，基因组发生双链断裂(double-strand breaks,dsbs)后，供体dna(序列与断裂位点两侧序列同源)在断裂位点处与受损基因组序列发生同源重组，实现修复，这一过程不易引入插入或缺失突变。nhej的基本过程为，断裂dna两端直接连接，不借助供体dna介导的同源重组，这一过程容易产生插入或缺失突变，引起密码子位移。在正常条件下，hdr引起同源重组的概率很低，但是通过内切酶在基因组上产生切口，并向细胞内转化线性的同源dna片段，可以极大地增加重组效率。而且将内切酶与具有位点识别功能的元件相结合，能实现高效的、特异性的基因组改造。
2、crispr/cas(clustered regulatory interspaced short palindromicrepeats/crispr associated)是广泛存在于细菌和古细菌中的一种生物防御系统。其中经过改造的ⅱ型系统，crispr/cas9，成为现在广泛使用的基因组改造工具。在guide rna(grna)的介导下，cas9蛋白识别基因组上protospacer adjacentmotif(pam)及其上游20bp序列，并在pam上游3bp位置产生双链切口。在同时提供供体dna(donor dna)的情况下，被crispr/cas9双链切开的基因可以hdr的方式重组入新的序列，以达到基因改造的目的。在酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)中，利用crispr/cas9系统进行基因组改造的实例很多，包括基因点突变、基因敲除和基因插入等。比如，在现有技术中流行的prcc-n质粒上同时具有cas9基因序列及grna元件，能够通过一次转化实现在酿酒酵母中的高效基因组改造。
3、东方伊萨酵母(issatchenkia orientalis)对恶劣的环境条件具有高度的耐受性，是一种很有前景的代谢工程宿主，可在酸性条件下利用含有发酵抑制剂的纤维素水解物生产燃料和化学品。目前东方伊萨酵母的编辑需要先构建ura3营养缺陷型突变后，再去进行其他基因的编辑，步骤较为繁琐，因此构建一个能够在东方伊萨酵母中稳定复制和表达的高效安全crispr/cas9系统，并且能够减少编辑步骤，是生物技术发展必需的。
技术实现思路
1、本技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种东方伊萨酵母crispr/cas9基因编辑系统及其应用。
2、为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：
3、第一方面，本技术提供了一种东方伊萨酵母crispr/cas9基因编辑系统，所述东方伊萨酵母crispr/cas9基因编辑系统包括cas9-grna融合质粒和供体dna序列；
4、所述cas9-grna融合质粒包括prcc-n质粒骨架、iocas9序列、grna基因表达盒序列；
5、所述grna基因表达盒从上游到下游依次包括grna启动子，引导序列，scaffoldrna序列和终止子；
6、所述grna启动子为iotef1基因启动子，核苷酸序列如seq id no:1所示；
7、所述iocas9序列的核苷酸序列如seq id no:2所示。
8、现有技术中，酵母中使用的prcc-n质粒上同时具有cas9基因序列及grna元件，能够通过一次转化实现在酵母中的高效基因组改造，但是在东方伊萨酵母中不能稳定复制和表达。
9、本技术构建了一种东方伊萨酵母专用，且可以在东方伊萨酵母中稳定复制、表达、并进行基因改造的crispr/cas9基因编辑系统。
10、其中，采用本技术的iocas9序列可以提高编辑效率，实现快速编辑东方伊萨酵母。本技术将prcc-n质粒中grna启动子替换为iotef1基因启动子，可以增强grna的表达量，达到提高编辑效率的目的，可以保证质粒中grna在东方伊萨酵母中高效转录。
11、作为本技术所述东方伊萨酵母crispr/cas9基因编辑系统的优选实施方式，所述引导序列的核苷酸序列如seq id no:3所示；所述scaffold rna序列的核苷酸序列如seqid no:4所示。
12、作为本技术所述东方伊萨酵母crispr/cas9基因编辑系统的优选实施方式，所述cas9-grna融合质粒包含与序列seq id no:5具有至少80％同一性的核苷酸序列。
13、优选地，所述cas9-grna融合质粒包含与序列seq id no:5具有至少80％、82％、85％、88％、90％、92％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一性的核苷酸序列。
14、更优选地，所述cas9-grna融合质粒包含与序列seq id no:5具有至少99％同一性的核苷酸序列。
15、本技术的cas9-grna融合质粒在东方伊萨酵母细胞中拷贝数高，可以稳定复制和表达，且可以快速编辑东方伊萨酵母，基因编辑率高。
16、作为本技术所述东方伊萨酵母crispr/cas9基因编辑系统的优选实施方式，所述供体dna序列为靶位点两侧序列同源的序列，所述供体dna序列为线性双链dna，所述线性双链dna的核苷酸序列如seq id no:6所示。
17、本技术所述东方伊萨酵母crispr/cas9基因编辑系统的优选实施方式，所述cas9-grna融合质粒的构建方法，包括以下步骤：
18、1)将prcc-n质粒中grna启动子置换为iotef1基因启动子，构建成质粒prcc-n-ptef1；
19、2)将prcc-n-ptef1质粒中cas9序列替换为适合东方伊萨酵母表达的iocas9，构建成质粒piocas9-ptef1；
20、3)将piocas9-ptef1质粒中抗性筛选标记基因的启动子的长度截短处理至200bp，即得cas9-grna融合质粒，命名为pio-cas1.0。
21、作为本技术所述东方伊萨酵母crispr/cas9基因编辑系统的优选实施方式，所述抗性筛选标记基因包括筛选标记基因nrsr。
22、本技术提供了上述东方伊萨酵母crispr/cas9基因编辑系统在编辑东方伊萨酵母基因组中的应用。
23、优选地，所述应用为：将所述cas9-grna融合质粒的引导序列替换为靶向ade2基因的引导序列，构建成pio-cas9-ade2质粒(用于ade2基因的敲除)；
24、以东方伊萨酵母基因组为模板，扩增ade2基因两侧各500-1000bp的dna片段，将纯化后的两个dna片段进行融合pcr，获得供体dna序列，命名为ade2-donor；
25、向东方伊萨酵母细胞中转化pio-cas9-ade2质粒和供体dna序列，获得编辑后的东方伊萨酵母细胞。
26、将本技术构建的pio-cas9-ade2质粒和prcc-n质粒编辑东方伊萨酵母中效率对比，可知本技术构建的pio-cas9-ade2质粒编辑东方伊萨酵母效率明显高于prcc-n质粒。
27、且pio-cas9-ade2质粒在东方伊萨酵母的拷贝数明显高于prcc-n质粒在东方伊萨酵母的拷贝数。
28、优选地，所述转化采用liac/ss carrier dna/peg方法。
29、与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：
30、本技术构建了一种东方伊萨酵母专用，且可以在东方伊萨酵母中稳定复制、表达、并进行基因改造的crispr/cas9基因编辑系统。其中，本技术构建的cas9-grna融合质粒在东方伊萨酵母细胞中拷贝数高，可以稳定复制和表达，且可以快速编辑东方伊萨酵母，基因编辑率高。本技术还利用改造抗性筛选标记基因的启动子序列来提高敲除质粒在酵母中的拷贝数，可以直接对东方伊萨菌株进行编辑。
1.一种东方伊萨酵母crispr/cas9基因编辑系统，其特征在于，所述东方伊萨酵母crispr/cas9基因编辑系统包括cas9-grna融合质粒和供体dna序列；
2.如权利要求1所述的东方伊萨酵母crispr/cas9基因编辑系统，其特征在于，所述引导序列的核苷酸序列如seq id no:3所示；所述scaffold rna序列的核苷酸序列如seq idno:4所示。
3.如权利要求1所述的东方伊萨酵母crispr/cas9基因编辑系统，其特征在于，所述cas9-grna融合质粒包含与序列seq id no:5具有至少80％同一性的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的东方伊萨酵母crispr/cas9基因编辑系统，其特征在于，所述cas9-grna融合质粒包含与序列seq id no:5具有至少99％同一性的核苷酸序列。
5.如权利要求1所述的东方伊萨酵母crispr/cas9基因编辑系统，其特征在于，所述供体dna序列为线性双链dna，所述线性双链dna的核苷酸序列如seq id no:6所示。
6.如权利要求1～4任一项所述的东方伊萨酵母crisprcas9基因编辑系统，其特征在于，所述cas9-grna融合质粒的构建方法，包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的东方伊萨酵母crisprcas9基因编辑系统，其特征在于，所述抗性筛选标记基因包括筛选标记基因nrsr。
8.如权利要求1～7任一项所述的东方伊萨酵母crispr/cas9基因编辑系统在编辑东方伊萨酵母基因组中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述cas9-grna融合质粒的引导序列替换为靶向ade2基因的引导序列，构建成pio-cas9-ade2质粒；
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述转化采用liac/ss carrier dna/peg方法。
