本发明涉及基因工程及生物医药领域，特别是涉及抑制猪c16orf62基因表达的grna在制备抗猪δ冠状病毒感染药物中的应用。
背景技术：
1、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus，简称pdcov)是引起仔猪严重腹泻和死亡的病原之一。该病毒已对全球养猪业构成严重威胁，并导致巨大的经济损失。该病毒于2012年被香港科学家首次报道，但并没有分离到该病毒。2014年年初，pdcov首次在美国猪场中被检测到，随后在韩国、加拿大等国的猪场中被检测到。胡慧教授首次利用猪睾丸细胞(st)和猪肾细胞(llc-pk1)从患病猪的粪便样品和肠道样品中分离出pdcov。尽管pdcov的成功分离，极大的推动了该病毒的基础与应用研究进程，但目前尚未开发出专门针对该病毒感染的有效治疗药物或疫苗，且人们对pdcov感染的机制仍知之甚少。前期研究表明，pdcov受体基因anpep的敲除并不能完全阻止病毒的感染，提示还有其他受体或辅助受体参与了病毒感染过程，解析冠状病毒对宿主的感染机制对研制广谱抗病毒药物的意义重大。
2、冠状病毒与细胞表面受体结合后，主要通过两个途径将基因组释放到细胞质中以启动复制过程：首先，病毒可以通过其囊膜直接与细胞膜融合的方式侵入细胞；其次，病毒粒子也可能通过内吞途径进入细胞，在早期内体、晚期内体或溶酶体中完成病毒囊膜与内体膜的融合，进而释放其基因组以进行复制。当位于细胞表面的受体被细胞或者病毒来源的配体结合后，将启动细胞的内吞过程，被内吞的受体及复合物的命运将由逆向囊泡转运复合物(又称retromer，由vps26、vps29和vps35组成)等转运复合物决定，一部分的受体及复合物通过循环内吞体介导，沿微管运输，最终回到质膜、反式高尔基体或病毒复制区域发挥其生理功能，另外一部分通过早期内体，继续被转运至晚期内体或溶酶体，最终被降解或者完成病毒基因组的释放过程。retriever是一种新型三聚体复合物，其结构和功能与retromer复合物相似，由c16orf62与vps26、vps29组成，被称为异源逆向囊泡转运复合物。两种复合物都定位于相同的内体结构域，与分选连接蛋白相关以进行特定的货物选择，将跨膜货物从内溶酶体途径分选回细胞表面。retromer在病毒感染过程中作用相对清楚，它可以与多种病毒蛋白或者病毒受体相互作用，从而影响病毒入侵、感染以及病毒的复制进程。例如，丙型肝炎病毒(hcv)，人乳头瘤病毒(hpv)，sars cov-2等。但retriever在病毒感染过程中的作用机制研究相对较少。
3、为鉴定pdcov的受体及感染相关的宿主因子，于pdcov易感细胞huh7建立了crispr/cas9高通量筛选平台，并利用该技术筛选了pdcov的受体和感染相关的宿主因子。通过该平台，本发明发现retriever复合物的关键基因c16orf62(又称vps35l)在pdcov感染组中被显著富集，目前尚无c16orf62参与冠状病毒感染的报道。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供抑制猪c16orf62基因表达的grna在制备抗猪δ冠状病毒感染药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过在llc-pk1细胞中敲除猪c16orf62基因，发现可抑制猪δ冠状病毒增殖，这为防控猪δ冠状病毒及其引起的疾病提供了新的策略。
2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
3、本发明提供一种抑制猪c16orf62基因表达的grna，所述grna的核苷酸序列为：5'-caaagaaagtgagccggaag-3'。
4、本发明还提供含有所述的grna的敲除载体或敲除细胞系。
5、本发明还提供含有所述的grna的试剂盒。
6、优选的是，所述试剂盒还包括用于检测猪c16orf62基因表达的引物对。
7、本发明还提供所述的grna或者所述的敲除载体或敲除细胞系或者所述的试剂盒在如下任一项中的应用：
8、(1)在鉴定猪c16orf62基因的功能中的应用；
9、(2)在制备抗猪δ冠状病毒感染药物或者细胞模型中的应用；
10、(3)在制备抑制猪δ冠状病毒在llc-pk1细胞中增殖的药物中的应用。
11、本发明还提供一种抑制猪c16orf62基因表达的突变细胞株的构建方法，包括以猪c16orf62基因为靶基因，利用crispr/cas9基因编辑系统敲除细胞中的c16orf62基因，构建抑制c16orf62基因表达的突变型细胞株；
12、所述crispr/cas9基因编辑系统的grna序列为5'-caaagaaagtgagccggaag-3'，所述c16orf62基因的核苷酸序列为如seq id no.1所示序列或者包含seq id no.1所示序列的基因序列。
13、优选的是，所述细胞包括猪细胞。
14、优选的是，所述猪细胞为猪肾细胞。
15、本发明还提供一种抑制猪c16orf62基因表达的突变细胞株，其由所述的构建方法构建。
16、本发明还提供所述的突变细胞株在筛选抑制猪δ冠状病毒增殖的靶标或者药物中的应用。
17、本发明公开了以下技术效果：
18、本发明通过crispr/cas9敲除技术在llc-pk1细胞中靶向敲除c16orf62，首次发现敲除c16orf62的细胞可以通过抑制pdcov的增殖从而抵抗pdcov的感染，该基因可作为pdcov的新型抗病靶点。本发明为研制有效安全防治pdcov的新型疫苗药物提供了新的靶标，也为抗pdcov的育种研究提供了新候选靶基因，具有广泛的应用前景。
1.一种抑制猪c16orf62基因表达的grna，其特征在于，所述grna的核苷酸序列为：5'-caaagaaagtgagccggaag-3'。
2.含有权利要求1所述的grna的敲除载体或敲除细胞系。
3.含有权利要求1所述的grna的试剂盒。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测猪c16orf62基因表达的引物对。
5.如权利要求1所述的grna或者权利要求2所述的敲除载体或敲除细胞系或者权利要求3-4任一项所述的试剂盒在如下任一项中的应用：
6.一种抑制猪c16orf62基因表达的突变细胞株的构建方法，其特征在于，包括以猪c16orf62基因为靶基因，利用crispr/cas9基因编辑系统敲除细胞中的c16orf62基因，构建抑制c16orf62基因表达的突变型细胞株；
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述细胞包括猪细胞。
8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述猪细胞为猪肾细胞。
9.一种抑制猪c16orf62基因表达的突变细胞株，其特征在于，其由权利要求6-8任一项所述的构建方法构建。
10.如权利要求9所述的突变细胞株在筛选抑制猪δ冠状病毒增殖的靶标或者药物中的应用。
