本发明属于寡聚脱氧核苷酸领域，具体涉及一种具有调节机体免疫能力的cpg寡聚脱氧核苷酸及其应用。
背景技术：
1、tlr9为哺乳类动物先天免疫受体，存在于内体(endosome)中，其配体是含未甲基化cpg的寡聚脱氧核苷酸(oligodeoxyribonucleotides，odn)。取决于不同类型和结构，cpg-odn进入内体后，可和tlr9结合激活irf-7或nf-κb信号通路，产生i型干扰素或il-6等炎症因子来干预免疫反应。
2、根据结构特征与免疫效应的区别，cpg odn可以分为a，b，c三种类型。a型cpg通过进入浆细胞样树突样细胞(pdc)的早期内体，和里面的tlr9受体结合，激活了irf-7信号通路，诱导了大量i型干扰素(ifn-α/ifn-β)和iii型干扰素(ifn-λ)的产生。i型干扰素作为一个总的免疫调节细胞因子,作用于下游的免疫细胞，包括但不限于nk细胞、cd8+t细胞、cd4+t细胞，γ/δt细胞、巨噬细胞等，诱导了ii型干扰素(ifn-γ)等细胞因子的产生。b型cpg是全硫代修饰的线性cpg odn，主要靶细胞是b淋巴细胞。b型cpg进入晚期内体和tlr9结合，激活nf-κb，产生一系列免疫反应，包括il-6、il-1和tnf-等炎症细胞因子分泌，促进b细胞增殖等。b型cpg可作为疫苗佐剂，显著提高抗体的水平。c型cpg是全硫代修饰的cpg odn，含有部分a型cpg的结构和部分b型cpg结构，其既有能形成二聚体的回文序列，又具有非回文的线性结构。c型cpg既可进入早期内体与tlr9结合也可进入晚期内体与tlr9结合。因此兼具a型和b型cpg-odn的活性，不但可以激活irf-7信号通路，也可激活nf-kb通路，产生i型干扰素和炎症细胞因子。c型cpg虽然兼顾了a型和b型cpg的特性，但其诱发干扰素和炎症分子的能力显著低于a型或b型cpg各自的活性。
3、b型cpg的临床前动物实验证明，其可成功治疗过敏性鼻炎、哮喘、各种微生物的感染、抗肿瘤。在过去的20多年，有一百多篇的文献关于cpg在临床前治疗各种疾病的报道。b型cpg的代表，cpg-1018，已在2017年被成功批准作为乙肝疫苗佐剂上市。
4、目前研究表明，当通过不同途径给药时，a型cpg odn可通过靶向pdc的tlr9，诱导产生强大的先天免疫(i/ii/iii型干扰素)和th1型免疫反应(dc，nk和cd8+t细胞的激活，il-12的产生)，并能调节免疫功能，从而抑制th2型和th17型免疫反应。通过这些免疫反应可治疗过敏性炎症和非过敏性炎症引起的疾病，抗病原微生物感染、直接或间接杀伤肿瘤细胞、减少aβ斑块的形成、提高疫苗的免疫原性等诸多作用。这也为其在传染病、癌症、免疫佐剂、过敏性鼻炎、特应性皮炎、哮喘、慢性阻塞性肺部疾病、嗜酸性粒细胞相关疾病、阿尔兹海默症、创伤愈合、伤口感染防治等领域中的应用奠定了基础(montamat et.,fronteersin immunol.2021.doi:10.3389/fimmu.2021.590054；scheiermann et al.,vaccine2014.32:6377-6389；shirota and klinman.,immunopotentiators in modernvaccines isbn 978-0-12-804019-5,http://dx.doi.org/10.1016/b978-0-12-804019-5.00009-8；beeh et al.,j allergy clin immunol 2013；131:866-74；hanagata n.etal.,int j nanomedicine.2012；7:2181-95；kayraklioglu et al.,.methods molbiol.2021；2197:51-85；fan et al.,clin cancer res.2012oct15；18(20):5628-38；senti et al.,clin exp allergy.2009apr；39(4):562-70；scholtzova et al.,actaneuropathol commun.2014sep 2；2:101；wanke-jellinek et al.,j immunol.2016jan15；196(2):767-77)。
5、由于a型cpg容易聚集的特性，其成药性很差，以至a型cpg被发现二十多年后，临床试验一直很少，没有被批准上市的药。历史上有三个机构试图通过各种方法来改善a型cpg的成药性：1.cytos biotechnology ag公司用病毒样颗粒(virus-like particles，vlp)包裹a型cpg(qbg-10)，虽然改善了成药性，但vlp的包裹使a型-cpg不再是单纯的cpg,而是有了很强佐剂功能的cpg(storni et al.,j.immunol.2004.172:1777-1785)；2.fda的科学家对a型cpg的3’端的5个g加入了fma(小分子化合物)，使其变成了对温度敏感的前药，待进到细胞后，在37℃时fma自动脱落，使a型cpg重新聚集而发挥药效，但这样的修饰并不能在体外完全防止聚集的发生，而且fma的修饰使药物的安全性，耐受性受到了限制(puig etal.,puig,nucleic acids research.2005.34:6488-6495)；3.日本的科学家在2015年报道，在对a型cpg 3’末端加上40个腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(poly-a)后，可使a型cpg的成药性大为改善。但因为多加了40个腺嘌呤，使生产成本大大增加，而且因为是全硫代，可增加il-6炎症分子的产生，使其安全性和耐受性受到了限制(aoshi et al.,j.immunol.research.2015.http://dx.doi.org/10.1155/2015/316364)。因此，传统a型cpg至今没有开发成药物的成功案例，临床试验也未见报道。
6、传统a型cpg设计的原理是通过8-12个核苷酸(其中包括1个或多个cpg)核心序列的完整回文及其二端的poly-g来达到聚体的产生。聚体可将cpg的核心序列提呈给早期内体上的tlr9而不是晚期内体上的tlr9，使其激活irf-7信号通路，产生i型干扰素。激活irf-7信号通路必须要聚体的形成(kerkmann et al.,j.bio.chem.,2005.280:8086-8093；wuet al.,j.bio.chem.,2004.279:33071-33078)。而单体cpg odn是不能激活irf-7信号通路的，如b型cpg在溶液中是单体，只能在晚期内体结合tlr9，从而激活nf-kb信号通路，诱导炎症因子而不是i型干扰素的产生。由于a型cpg必须形成聚体才有活性，但聚体的产生往往容易形成不可控的大的聚集体，极大降低了成药性。这就是a型cpg发明之后，至今未见临床研发成功案例的主要原因。因此，怎样保证a型cpg具有聚集性，同时又使聚集可控，成为这类分子能否开发为成临床有效药物的关键。
7、传统a型cpg的自聚模型由kerkmann等在2005年提出(kerkmann et al.,j.bio.chem.,2005.280:8086-8093)：二个回文互补的单体通过watson-crick连接形成二聚体，二聚体二端的poly-g通过鸟苷酸的氢键形成hoogsteen碱基配对，变成四聚体(g-tetrad)。然后二聚体和四聚体通过g-tetrad继续聚集，以此循环，形成更大的聚体。另一个模型基于a型cpg的二级结构，a型cpg单体可以在单体内形成回文结构，其二端的poly-g可以互相通过hoogsteen配对形成更高的聚体。因此，从这些模型可以获知，聚集体的大小和稳定性取决于周围hoogsteen连接的多少和其独特的空间结构。我们早期研究发现，从二级结构来看，在poly-g前后完全回文的形式可以使聚集所需的能量减少，使聚集易于形成。因此通过polyg和回文之间建立一定的空间阻隔可能使形成g-tetrad的能量增加，使聚体相对不易形成或形成后相对松散。同时，结合对二端poly g数量的选择，可能使聚体稳定在一定的大小范围内。本发明基于以上考量，设计了多条核心序列，同时在核心系列保持不变的情况下，对a型cpg的二端进行了脱氧核糖核苷酸替换实验，找出了a型cpg聚体形成规律，并发现了其和刺激产生i型干扰素之间的关系。
技术实现思路
1、本发明的技术方案如下：
2、一种具有调节机体免疫能力的cpg寡聚脱氧核苷酸，本发明所述的一种具有调节机体免疫能力的cpg寡聚脱氧核苷酸，其序列结构为5’-(g)n-核心序列-(n)q-(g)m-3’的序列中的一种，所述核心序列为回文序列，所述n为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(a)、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(t)、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(c)三种碱基中的任意一种；所述g为鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸；所述q、n、m均为整数；所述n取值范围为2～11，所述q取值范围为0～10，所述m取值范围为2～11。
3、优选地，所述n取值范围为3～4，所述q取值范围为1-5。
4、优选地，所述的核心序列为cgcgacgcgtcgcg、acgatcgagatcgt、aggatcg atcct、ttcgatcgatcgaa、cgatcgatcg、gacgatcgtc、tgcatcgatgca中的至少一种；所述的核心序列为cgcgacgcgtcgcg时，所述q的取值范围为0～10，所述n的取值范围为0～3，所述m的取值范围为2～11；
5、或，所述的核心序列为acgatcgagatcgt时，所述q的取值范围为0～10，所述n取值范围为2～11，所述m的取值范围为2～11；
6、或，所述的核心序列为aggatcgatcct时，所述q的取值范围为0～10，所述n取值范围为2～11，所述m的取值范围为2～11；
7、或，所述的核心序列为ttcgatcgatcgaa时，所述q的取值范围为0～10，所述n取值范围为2～11，所述m的取值范围为2～11；
8、或，所述的核心序列为cgatcgatcg时，所述q的取值范围为0～10，所述n取值范围为1～11，所述m的取值范围为2～11；
9、或，所述的核心序列为gacgatcgtc时，所述q为0，所述n取值范围为0～3，所述m的取值范围为2～11；或所述q的取值范围为1～10，所述n取值范围为2～11，所述m的取值范围为2～11；
10、或，所述的核心序列为tgcatcgatgca时，所述q为0，所述n的取值为1,3,4或5，所述m的取值范围为2～11；或所述q的取值范围为1～10，所述n取值范围为2～11，所述m的取值范围为2～11。
11、优选地，上述cpg寡聚脱氧核苷酸至少包括seq id no.1～seq id no.82所示脱氧核苷酸序列中的一种。
12、优选地，所述cpg寡聚脱氧核苷酸本身或含有硫代修饰、氟代修饰、甲氧基修饰、锁核酸修饰、纳米粒子修饰中的至少一种。
13、优选地，所述硫代修饰的位点在5’端和/或3’端的多聚鸟苷酸上。
14、优选地，所述纳米粒子修饰中采用的纳米粒子包括plga、壳聚糖、脂质纳米粒、脂质体中的至少一种。
15、一种cpg寡聚脱氧核苷酸制剂，包括上述cpg寡聚脱氧核苷酸和辅料，所述辅料包括ph缓冲对、甘氨酸、海藻糖、甘露醇、蔗糖、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘油、丙二醇、pluronic f127、pluronic f68、tween 20、tween 80、苯扎氯铵、依地酸二钠、枸橼酸钠、羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素钠、甲基倍他环糊精、聚乙二醇中的至少一种。
16、优选地，所述cpg寡聚脱氧核苷酸制剂的金属离子包括钠、钾、镁、钙、锌、铁，总浓度范围在0.1-90mm。
17、优选地，所述cpg寡聚脱氧核苷酸制剂的ph值在7-9之间。
18、一种上述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备调节呼吸道免疫反应药物中的应用。
19、一种上述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备预防和治疗呼吸道疾病的药物中的应用，所述呼吸道疾病包括呼吸道病毒感染性疾病、呼吸道细菌感染性疾病、呼吸道真菌感染性疾病、呼吸道寄生虫感染疾病、呼吸道过敏性疾病中的至少一种。呼吸道病毒感染中所述呼吸道病毒包括covid-19病毒、流感病毒、rsv病毒、sars-cov中的至少一种。
20、一种上述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备预防和治疗非通过呼吸道感染疾病的药物中的应用，所述非通过呼吸道感染疾病包括hiv病毒感染、hbv病毒感染、hcv病毒感染中的至少一种。
21、一种上述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备调节免疫细胞增殖功能的药物或调节免疫细胞细胞因子释放的药物中的应用。
22、一种上述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备免疫佐剂中的应用。
23、一种上述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备预防和治疗病毒感染的药物中的应用。
24、一种上述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备治疗肿瘤药物中的应用，所述药物中cpg寡聚脱氧核苷酸为唯一的抗肿瘤药效组分。
25、一种抗肿瘤组合物，包括上述cpg寡聚脱氧核苷酸和抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物包括但不限于pd-1抗肿瘤药物、pdl-1抗肿瘤药物和抗肿瘤细胞疗法，所述组合物中cpg寡聚脱氧核苷酸作为具有抗肿瘤药效的组分或免疫佐剂。
26、一种上述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备人用或动物用疫苗中的应用。
27、一种上述cpg寡聚脱氧核苷酸在治疗中枢神经系统疾病中的应用，所述中枢神经系统疾病包括但不限于阿尔兹海默症。
28、一种上述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备防治创伤后二度感染药物中的应用。
29、一种上述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备促进伤口愈合药物中的应用。
30、一种上述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备治疗过敏性鼻炎和/或特应性皮炎和/或哮喘和/或慢性阻塞性肺部疾病和/或嗜酸性粒细胞相关疾病药物中的应用。
31、一种采用上述cpg寡聚脱氧核苷酸制备的药物，所述药物的剂型为注射剂、片剂、冻干剂、吸入剂、滴鼻剂、鼻喷雾剂、肛门栓剂、滴眼液、涂抹剂、洗剂、凝胶剂。
32、一种上述cpg寡聚脱氧核苷酸外用制剂：包括权利要求1～5中任一项所述cpg寡聚脱氧核苷酸和辅料，所述辅料包括山嵛酸甘油酯，液状石蜡，凡士林，中链甘油三酯，椰油酰基辛癸酸酯，单双硬脂酸甘油酯，羟丙甲纤维素，卡波姆，黄原胶，羧甲基纤维素钠，泊洛沙姆407，聚乙二醇十六十八醇醚，泊洛沙姆188，油酰聚氧乙烯甘油酯，聚乙二醇-7硬脂酸酯，辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯，十二烷基硫酸钠，丙二醇单脂肪酸脂，聚甘油油酸酯，月桂酸丙二醇酯，丙二醇，肉豆蔻酸异丙酯，聚甘油油酸酯。
33、一种上述cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂及与其他类型佐剂组合的制剂用于人用或动物用疫苗：包括cpg寡聚脱氧核苷酸自身或和其他类型的佐剂组合，所述其他类型的佐剂优选氢氧化铝和磷酸铝。
34、本发明取得的有益效果：
35、和传统的a型cpg完全回文设计不同，本发明提供了一种全新结构、全新序列的cpgodn序列。这些序列通过对odn两端的核苷酸进行了替换，找出了其成药性和活性之间的关系及相关规律。相比已发表的序列，具有独特的一级结构及二级结构，克服了传统a型cpg易聚集成药性差的难题，具有更高的免疫活性和成药性，特别是am1012-05序列，其形成的二级结构比同类产品在高温下更加稳定，其聚集体可控性比其他同类型序列更优，在生产过程中，批次间稳定性更好，有更好的成药性。同时，am1012-05能有效穿过人呼吸道上皮黏膜(rpmi 2650细胞)渗透膜型，在动物上也表现出优秀的免疫激活活性，具有优秀的阻断呼吸道病毒感染和传播，通过激活和调节免疫系统发挥抗肿瘤、治疗过敏性鼻炎、哮喘、慢性阻塞性肺部疾病、嗜酸性粒细胞相关疾病、特应性皮炎、阿尔兹海默症及应用于创伤后二次感染的防治及促进伤口愈合药物中的潜力。同时，具有作为疫苗独立佐剂或者佐剂系统组分的潜力。
1.一种具有调节机体免疫能力的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述cpg寡聚脱氧核苷酸是结构为5’-(g)n-核心序列-(n)q-(g)m-3’的序列中的一种，所述核心序列为回文序列，所述n为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸a、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸t、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸c三种碱基中的任意一种；所述g为鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸；所述q、n、m均为整数，所述n取值范围为2～11，所述q取值范围为0～10，所述m取值范围为2～11。
2.根据权利要求1所述的具有调节机体免疫能力的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于：所述n取值范围为3～4，所述q取值范围为1-5。
3.根据权利要求1所述的具有调节机体免疫能力的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于：
4.根据权利要求1所述具有调节机体免疫能力的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于：至少包括seq id no.1～seq id no.82所示脱氧核苷酸序列中的一种。
5.根据权利要求1～4任一所述具有调节机体免疫能力的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于：所述cpg寡聚脱氧核苷酸本身或含有硫代修饰、氟代修饰、甲氧基修饰、锁核酸修饰、纳米粒子修饰中的至少一种。
6.根据权利要求5所述具有调节机体免疫能力的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于：所述硫代修饰的位点在5’端和/或3’端的多聚鸟苷酸上。
7.根据权利要求5所述具有调节机体免疫能力的cpg寡聚脱氧核苷酸，其特征在于：所述纳米粒子修饰中采用的纳米粒子包括plga、壳聚糖、脂质纳米粒、脂质体中的至少一种。
8.一种cpg寡聚脱氧核苷酸溶液制剂，其特征在于：包括权利要求1～7中任一项所述cpg寡聚脱氧核苷酸和辅料，所述辅料包括ph缓冲对、甘氨酸、海藻糖、甘露醇、蔗糖、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘油、丙二醇、pluronic f127、pluronic f68、tween 20、tween80、苯扎氯铵、依地酸二钠、枸橼酸钠、羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素钠、甲基倍他环糊精、聚乙二醇中的至少一种。
9.根据权利要求8所述一种cpg寡聚脱氧核苷酸溶液制剂，其特征在于：所述cpg寡聚脱氧核苷酸制剂的金属离子包括钠、钾、镁、钙、锌、铁，总浓度范围在0.1-90mm。
10.根据权利要求8所述一种cpg寡聚脱氧核苷酸溶液制剂，其特征在于：所述cpg寡聚脱氧核苷酸制剂的ph值在7-9之间。
11.一种如权利要求1～7任一项所述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备调节呼吸道免疫反应药物中的应用。
12.一种如权利要求1～7任一项所述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备预防和治疗呼吸道疾病的药物中的应用，其特征在于，所述呼吸道疾病包括呼吸道病毒感染性疾病、呼吸道细菌感染性疾病、呼吸道真菌感染性疾病、呼吸道寄生虫感染疾病、呼吸道过敏性疾病中的至少一种。
13.根据权利要求12所述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备预防和治疗呼吸道疾病的药物中的应用，其特征在于，所述呼吸道病毒包括covid-19病毒、流感病毒、rsv病毒、sars-cov中的至少一种。
14.一种如权利要求1～7任一项所述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备预防和治疗非通过呼吸道感染疾病的药物中的应用，其特征在于，所述非通过呼吸道感染疾病包括hiv病毒感染、hbv病毒感染、hcv病毒感染中的至少一种。
15.一种如权利要求1～7任一项所述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备调节免疫细胞增殖功能的药物或调节免疫细胞细胞因子释放的药物中的应用。
16.一种如权利要求1～7任一项所述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备免疫佐剂中的应用。
17.一种如权利要求1～7任一项所述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备预防和治疗病毒感染的药物中的应用。
18.一种如权利要求1～7任一项所述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述药物中cpg寡聚脱氧核苷酸为唯一的抗肿瘤药效组分。
19.一种抗肿瘤组合物，其特征在于，包括权利要求1～6任一项所述cpg寡聚脱氧核苷酸和抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物包括但不限于pd-1抗肿瘤药物、pdl-1抗肿瘤药物和抗肿瘤细胞疗法，所述组合物中cpg寡聚脱氧核苷酸作为具有抗肿瘤药效的组分或免疫佐剂。
20.一种如权利要求1～7任一项所述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备人用或动物用疫苗中的应用。
21.一种如权利要求1～7任一项所述cpg寡聚脱氧核苷酸在治疗中枢神经系统疾病中的应用，其特征在于，所述中枢神经系统疾病包括但不限于阿尔兹海默症。
22.一种如权利要求1～7任一项所述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备防治创伤后二度感染药物中的应用。
23.一种如权利要求1～7任一项所述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备促进伤口愈合药物中的应用。
24.一种如权利要求1～7任一项所述cpg寡聚脱氧核苷酸在制备治疗过敏性鼻炎和/或特异性皮炎和/或哮喘和/或慢性阻塞性肺部疾病和/或嗜酸性粒细胞相关疾病药物中的应用。
25.一种采用权利要求1～7任一项所述cpg寡聚脱氧核苷酸制备的药物，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂、片剂、冻干剂、吸入剂、滴鼻剂、鼻喷雾剂、肛门栓剂、滴眼液、涂抹剂、洗剂、凝胶剂。
26.一种cpg寡聚脱氧核苷酸外用制剂，其特征在于：包括权利要求1～7中任一项所述cpg寡聚脱氧核苷酸和辅料，所述辅料包括山嵛酸甘油酯，液状石蜡，凡士林，中链甘油三酯，椰油酰基辛癸酸酯，单双硬脂酸甘油酯，羟丙甲纤维素，卡波姆，黄原胶，羧甲基纤维素钠，泊洛沙姆407，聚乙二醇十六十八醇醚，泊洛沙姆188，油酰聚氧乙烯甘油酯，聚乙二醇-7硬脂酸酯，辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯，十二烷基硫酸钠，丙二醇单脂肪酸脂，聚甘油油酸酯，月桂酸丙二醇酯，丙二醇，肉豆蔻酸异丙酯，聚甘油油酸酯。
27.一种cpg寡聚脱氧核苷酸佐剂及与其他类型佐剂组合的制剂用于人用或动物用疫苗，其特征在于：包括权利要求1～7中任一项所述cpg寡聚脱氧核苷酸自身或其和氢氧化铝佐剂或者磷酸铝佐剂的组合。
