本发明涉及生物工程，具体涉及一种高效表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌及其应用。
背景技术：
1、类风湿关节炎(ra)是一种自身免疫性疾病，全球有超过4600万患者，对社会和经济构成重大负担。类风湿关节炎主要表现为关节持续性炎症，导致疼痛、肿胀，久而久之可引发关节畸形和功能丧失。当前治疗ra的方法主要依赖于非甾体抗炎药(nsaids)、疾病修饰抗风湿药物(dmards)、生物制剂和皮质类固醇等，虽然这些方法在一定程度上能够减缓病情进展和控制症状，但长期使用可能导致副作用，如胃肠道不适、心血管问题及潜在感染风险。此外，这些治疗方案通常成本高昂，对于许多患者来说并不可持续。此外，部分患者可能对现有药物产生耐药性或药物效果不佳，迫切需要新的治疗方法。因此，寻找一种安全、经济的治疗策略是目前ra治疗领域的重要研究方向。
2、近年来，基因工程技术的进步为治疗各种疾病提供了新途径，特别是crispr/cas9基因编辑技术，因其精确性、高效率和操作简便性，已成为生物医学研究的有力工具。尽管crispr/cas9在治疗遗传性疾病方面已取得初步成果，但在慢性炎症性疾病，特别是ra的应用，还处于探索阶段。
3、β-葡萄糖苷酶是一种能够分解葡萄糖苷，释放出具有活性化合物(如异黄酮)的酶。在ra治疗中，增加异黄酮等成分的生物利用度，可能是减轻症状和疾病进展的有效手段。当前，尽管有研究指出β-葡萄糖苷酶在提高药物生物可用性方面的潜力，但如何高效地将此类酶引入治疗仍是挑战。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高效表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌及其应用。
2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
3、(1)设计引物扩增β-葡萄糖苷酶基因；
4、(2)分别设计引物从大肠杆菌基因组克隆启动子nirb基因、attλ位点的上游同源臂和下游同源臂；
5、(3)设计引物从ptargetf质粒克隆grna序列；
6、(4)使用引物对ptargetf质粒进行线性化；
7、(5)将所述grna、attλ位点上游同源臂、启动子nirb基因、β-葡萄糖苷酶基因和attλ位点下游同源臂通过同源重组依次构建到所述线性化的ptargetf质粒骨架，得重组质粒ptargetf-bgc；
8、(6)将pcas质粒转入大肠杆菌感受态细胞，得成功整合pcas质粒的感受态细胞；再将重组质粒ptargetf-bgc转入成功整合pcas质粒的感受态细胞，得所述表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌。
9、本发明基于crispr/cas9介导的基因编辑技术，通过引物设计合成了ptargetf-bgc质粒，通过ptargetf-bgc质粒将β-葡萄糖苷酶基因整合入e.coli nissle 1917的基因组，实现β-葡萄糖苷酶的稳定高校表达。
10、作为本发明所述表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌的构建方法的优选实施方式，所述步骤(1)中用于扩增β-葡萄糖苷酶基因的引物的核苷酸序列如seq id no：1和seq idno：2所示。
11、作为本发明所述表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌的构建方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，用于克隆启动子nirb基因的引物的核苷酸序列如seq id no：3和seq id no：4所示；用于克隆attλ位点上游同源臂的核苷酸序列如seq id no：5和seq id no：6所示；用于克隆attλ位点下游同源臂的核苷酸序列如seq id no：7和seq id no：8所示。
12、作为本发明所述表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌的构建方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，用于克隆grna序列的引物的核苷酸序列如seq id no：9和seq id no：10所示。
13、作为本发明所述表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌的构建方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，用于线性化ptargetf质粒的引物的核苷酸序列如seq id no：11和seq idno：12所示。
14、作为本发明所述表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌的构建方法的优选实施方式，所述步骤(1)中的β-葡萄糖苷酶基因从狄氏副拟杆菌中克隆得到。
15、作为本发明所述表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌的构建方法的优选实施方式，所述步骤(6)中大肠杆菌为e.coli nissle 1917。
16、本发明还提供所述的构建方法构建得到的表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌。
17、本发明还提供所述的表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌在制备用于治疗类风湿关节炎的药物中的应用。
18、本发明还提供一种用于治疗类风湿关节炎的药物组合物，所述药物组合物包括所述的表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌。
19、本发明的有益效果：本发明提供基于crispr/cas9技术，对公认的益生菌—大肠杆菌(e.coli nissle 1917)进行基因改造，构建一种全新的基因工程菌，该工程菌实现了β-葡萄糖苷酶的高效表达，将该基因工程菌应用于类风湿关节炎的治疗中，能够提高活性分子的生物利用度、降低治疗成本、减少药物副作用，为类风湿关节炎的治疗提供一种新的途径，具有很好的应用前景。
1.一种表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中用于扩增β-葡萄糖苷酶基因的引物的核苷酸序列如seq id no：1和seq idno：2所示。
3.根据权利要求1所述的表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，用于克隆启动子nirb基因的引物的核苷酸序列如seq id no：3和seq id no：4所示；用于克隆attλ位点上游同源臂的核苷酸序列如seq id no：5和seq id no：6所示；用于克隆attλ位点下游同源臂的核苷酸序列如seq id no：7和seq id no：8所示。
4.根据权利要求1所述的表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，用于克隆grna序列的引物的核苷酸序列如seq id no：9和seq id no：10所示。
5.根据权利要求1所述的表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中，用于线性化ptargetf质粒的引物的核苷酸序列如seq id no：11和seq idno：12所示。
6.根据权利要求1所述的表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中的β-葡萄糖苷酶基因从狄氏副拟杆菌中克隆得到。
7.根据权利要求1所述的表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(6)中大肠杆菌为e.colinissle 1917。
8.根据权利要求1-7任一项所述的构建方法构建得到的表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌。
9.权利要求8所述的表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌在制备用于治疗类风湿关节炎的药物中的应用。
10.一种用于治疗类风湿关节炎的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求8所述的表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌。
