本发明属于动物疫病防控检测领域，具体涉及一种抗i群8b型禽腺病毒单克隆抗体及其应用，尤其是在建立检测i群8b型禽腺病毒间接免疫荧光方法中的应用。
背景技术：
1、禽腺病毒(fowl adenoviruses，fadv)属腺病毒科的禽腺病毒属成员，为无囊膜的双股dna病毒，根据抗原结构不同分为i、ii、iii群：i群禽腺病毒(fadv-i)包括从鸡、火鸡、鹅、鸭和鸽子等禽类中分离出来的传统禽腺病毒，具有共同的群抗原，代表毒株为鸡胚致死孤儿病毒(celov)；ii群禽腺病毒(fadv-ii)属于唾液酸酶腺病毒属，不存在与i群病毒相同的群抗原，包括火鸡出血性肠炎等相关病毒；iii群禽腺病毒(fadv-iii)属胸腺病毒属，仅只有减蛋综合征病毒，与fadv-i表现出部分相同的群抗原。
2、fadv-i根据病毒基因序列和血清交叉中和试验分为5个基因型(fadva～e)和12个血清型(fadv-1～8a，fadv-8b～11)。fadv-i广泛分布于世界各地，所有年龄段的禽类都易感，除了感染鸡外，从火鸡、鸽子、虎皮鹦鹉和绿头鸭中也发现了该病毒的感染。不同血清型的fadv-i有不同的毒力，对家禽有不同的致病能力。例如fadv-1和fadv-4主要引起禽类的肌胃糜烂、溃疡和心包积液肝炎综合征。血清2、7、8a、8b、11型则在世界范围内引起包涵体肝炎(inclusion body hepatitis，ibh)症状。
3、fadv-8b病毒引起的包涵体肝炎最早于1963于美国发现，1976年我国台湾省有报道，1988年后我国湖南、江苏等省市陆续有该病的报道。2015年之后，该病在山东、吉林、河南、河北等地的感染率逐渐增加。7日～20周龄鸡均可感染fadv-8b，其中3～7周龄鸡最易感，发病雏鸡主要表现为生长受阻、羽毛蓬乱、蹲伏，多于48h内死亡或逐渐恢复，该病引起的死亡率较低，为10％～30％。发病鸡剖检可见典型的ibh症状，即肝脏出血、质脆、肿胀发黄，部分有轻微心包积液或肾脏肿胀和出血等病理变化。ibh鸡肝脏经he染色后，在光学显微镜下可见核内包涵体。
4、fadv-8b的致病机理以及在我国的流行原因并不是很明确，由于临床目前尚无批准的疫苗，其引起的产蛋量下降、饲料转化率低、免疫力下降等症状，给我国家禽养殖业造成巨大的经济损失。该病既可水平传播也可垂直传播，若种鸡产蛋期带毒，可大大增加商品鸡发病率和死亡率，因此开发针对fadv-8b的检测物质与检测方法，满足食品安全、屠宰、检测机构的检测要求具有重要意义。
5、防止fadv-8b的传播是控制包涵体肝炎发生的重要环节，而加强检疫是防止fadv-8b传播的关键，因此灵敏、有效的病毒检测技术非常重要。然而，目前国内的检测方法和试剂盒主要针对i群禽腺病毒和血清4型禽腺病毒，例如农业标准ny/t 4027-2021i群禽腺病毒检测方法中，检测方法包括临床诊断、pcr检测、荧光pcr检测、ifa鉴定、病毒分离培养等，无法区分具体感染的血清型；专利202010304439.9(2020)公开了一种检测禽腺病毒i群的间接免疫荧光试剂盒，同样无法区分具体感染的血清型；专利cn116622643a公开了血清4型禽腺病毒100k蛋白单克隆抗体的制备与应用，只针对血清4型禽腺病毒的诊断；专利cn113981145a公开了一种i群禽腺病毒a、b、c、d和e种的检测方法和检测试剂盒，通过荧光定量pcr的方法可以区分i群不同基因型而无法区分血清型；专利cn202111061712公开了鉴定i群禽腺病毒血清8型的方法，通过lamp方法能够同时鉴定fadv-8a和fadv-8b，而无法区分这两种血清型。目前能确定i群8b型禽腺病毒的方法只能通过扩增hexon基因送测序后上传genbank进行blast分析。
6、本发明提供一种抗i群8b型禽腺病毒单克隆抗体并建立了间接免疫荧光检测方法能够鉴定出fadv-8b血清型病毒，与i群禽腺病毒其他11个血清型以及禽呼肠孤等常见禽源病毒产生交叉反应，便捷高效，可操作性强，具有较高的特异性和灵敏度。推广和使用该方法有利于fadv-8b的临床检测和流行病学调查，为fadv-8b的防控诊断提供基础。
技术实现思路
1、本发明目的在于提供一种抗i群8b型禽腺病毒单克隆抗体及其应用。
2、本发明的另一目的在于提供一种检测i群禽腺病毒8b血清型病毒的间接免疫荧光方法。本发明对fadv-1的12个血清型毒株的hexon基因进行分析，选取fadv-8b hexon蛋白特异性序列进行二级结构、亲疏水性、抗原性等分析，选取特异性抗原表位序列，连接原核表达载体，进行目的蛋白的表达和纯化，制备免疫原免疫小鼠进行单克隆抗体制备，建立间接免疫荧光检测方法，对fadv-8b进行特异性检测和鉴定。
3、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
4、第一方面，本发明请求保护一种分泌抗i群8b型禽腺病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株fadv-8b-hexon，其保藏号为cctcc no:c2024188。
5、第二方面，本发明请求保护由上述杂交瘤细胞株分泌的抗i群8b型禽腺病毒单克隆抗体。
6、第三方面，本发明请求保护上述抗i群8b型禽腺病毒单克隆抗体在如下至少一种中的应用；
7、1)制备检测i群8b型禽腺病毒的产品；
8、2)非诊疗目的的检测i群8b型禽腺病毒。
9、第四方面，本发明请求保护一种产品，其包括上述的抗i群8b型禽腺病毒单克隆抗体。进一步，所述产品具有检测i群8b型禽腺病毒的功能。
10、本发明所述产品为试剂盒。所述的试剂盒中包括抗i群8b型禽腺病毒的单克隆抗体，fitc标记的羊抗鼠二抗，样品稀释液(pbs)和洗涤液(pbst)。
11、第五方面，本发明请求保护一种非诊疗目的的检测i群8b型禽腺病毒的间接免疫荧光检测方法，以上述的抗i群8b型禽腺病毒单克隆抗体作为抗体，检测待测样品中是否含有i群8b型禽腺病毒。进一步，该方法为：向待测样品中加入抗i群8b型单克隆抗体，孵育洗涤后加入fitc羊抗鼠二抗，孵育洗涤后倒置荧光显微镜下进行观察，若细胞内出现特异性绿色荧光，则样品判为i群8a型禽腺病毒阳性，否则为阴性。
12、本发明根据i群8b型禽腺病毒六邻体(hexon)蛋白特异性序列(如seq id no.1所示)制备的抗i群8b型禽腺病毒的单克隆抗体，可以特异性识别i群8b型禽腺病毒，不与i群禽腺病毒其他11个血清型以及edsv、禽呼肠孤等其他禽源病毒发生交叉反应。hexon蛋白是禽腺病毒重要的结构蛋白，该蛋白中l环区域的蛋白序列变异性最高，含有特异性抗原决定簇，是病毒血清型分型的依据。
13、分泌抗i群8b型禽腺病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为i群8b型禽腺病毒hexon蛋白杂交瘤细胞株，简称fadv-8b-hexon。于2024年6月26日送中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏号为cctcc no:c2024188。
14、本发明建立了一种检测i群8b型禽腺病毒的间接免疫荧光检测方法，该检测方法的建立过程包括以下步骤：
15、(1)i群8b型禽腺病毒hexon蛋白免疫原的制备：分析i群禽腺病毒12个血清型的hexon基因参考序列，选取其中变异最大的部分进行抗原表位分析，包括蛋白序列的二级结构、亲疏水性等，选取长度为756bp的核酸序列，并分别在5’端和3’端加入ndeⅰ和hindⅲ酶切位点，生工生物工程(上海)股份有限公司合成后，与pet28a载体一起分别用ndeⅰ和hindⅲ进行双酶切，回收载体与双酶切片段进行连接，测序鉴定正确后转化rossetta感受态细胞进行诱导表达和纯化。纯化后的目的蛋白浓度为不低于1mg/ml，纯度不低于90％，作为i群8b型禽腺病毒单克隆抗体制备的免疫原。
16、(2)i群8b型禽腺病毒单克隆抗体的制备：选取10只6～8周龄、体型适中的健康balb/c雌性小鼠分别免疫hexon纯化蛋白。蛋白和佐剂的比例按照1:1(v:v)混合，乳化完全后每只小鼠免疫剂量为100μg/只，免疫体积为200μl，初次免疫后加强免疫3次，通过背部皮下多点注射，每次免疫间隔14天，在四免2周后时通过眼眶静脉丛采血按照
17、(3)中方法检测免疫小鼠血清中的抗体效价，当小鼠血清抗体效价达到细胞融合条件时，进行腹腔注射加强免疫，加强免疫后3～5天内取脾细胞进行细胞融合。
18、(3)免疫balb/c小鼠血清效价的检测方法：小鼠四免2周后，通过眼眶静脉丛采血分离血清，以纯化的hexon蛋白作为包被抗原，包被浓度为2μg/ml，4℃过夜，用pbst洗涤3次后，用含2％脱脂奶粉(2g脱脂奶粉加入100ml pbst缓冲液中)的pbst封闭2h，pbst洗涤3次，3min/次，甩掉洗液，置于4℃备用。用免疫小鼠血清作为阳性血清进行2倍倍比稀释，空白组小鼠血清作为阴性血清，加入到酶标板中，每孔加入100μl，37℃孵育60min，随后用pbst清洗3次，3min/次。每孔加入1:5000稀释的fitc-羊抗鼠二抗，100μl/孔，37℃孵育1h，pbst洗涤3次，3min/次。每孔加入100μl显色液，避光显色10min。孵育结束后每孔加入50μl终止液，终止反应。放进酶标仪中读取od450值。
19、(4)杂交瘤细胞的融合与筛选：选取血清效价高的balb/c小鼠，拉颈处死后置于75％酒精中浸泡5min消毒。将消好毒的小鼠固定，取出脾脏，放入匀浆器中加入基础培养液研磨，静置后离心去上清，加入适当体积的hat选择培养液重悬细胞。将制备的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0采用peg方法进行融合，制备杂交瘤细胞。通过hat培养基筛选融合后的杂交瘤细胞，观察细胞生长情况，当保留生长状态良好的杂交瘤细胞，取细胞融合后第10～14天的细胞上清进行抗体鉴定，将分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株编号，采用有限稀释法对阳性细胞株连续扩大培养，直至细胞阳性率达100％时，保存毒株，冻存。免疫小鼠，制备腹水，用protein-a亲和纯化，获得i群8b型禽腺病毒单克隆抗体。
20、(5)i群8b型禽腺病毒的间接免疫荧光方法的建立：该检测方法包括i群8b型禽腺病毒单克隆抗体，商品化的fitc羊抗鼠(购自sigma公司)。该免疫荧光检测的步骤及阳性标准判定如下：将待检样品接种长成良好单层的鸡肝癌细胞(lmh)，置于37℃、含5％co2培养箱中培养大约48～60h后，弃去细胞培养液，用冷甲醇固定15min后弃去甲醇，开盖置于室温中至少10min使甲醇挥发，用pbst洗涤一遍后，加入稀释后的抗i群8b型单克隆抗体，置于37℃孵育1h，经pbst洗涤3遍后轻轻甩干，加入1:5000稀释的fitc羊抗鼠二抗，37℃孵育1h后pbst洗涤3遍，轻轻甩干后于倒置荧光显微镜下进行观察。若细胞内出现特异性绿色荧光，则样品判为i群8a型禽腺病毒阳性，否则为阴性。
21、本发明所述的室温为25±10℃，但不限于此。
22、本发明的有益效果：
23、本发明涉及一种抗i群8b型禽腺病毒单克隆抗体的制备以及i群8b型禽腺病毒间接免疫荧光检测方法的建立。本发明中的抗i群8b型禽腺病毒单克隆抗体，是根据i群8b型禽腺病毒hexon结构蛋白不同血清型变异区制备，可特异性识别i群8b型禽腺病毒，而不与其他11个i群禽腺病毒血清型以及禽呼肠孤病毒等病毒发生交叉反应。本发明建立的方法具有良好的特异性和敏感性，该方法可用于临床上对i群8b型禽腺病毒的准确检测和流行病学调查。
24、保藏说明
25、培养物名称：杂交瘤细胞株fadv-8b-hexon
26、分类命名：杂交瘤细胞株 fadv-8b-hexon hybridoma cell line fadv-8b-hexon
27、保藏机构：中国典型培养物保藏中心
28、保藏机构简称：cctcc
29、地址：中国武汉大学
30、保藏日期：2024年6月26日
31、保藏中心登记入册编号：cctcc no:c2024188。
1.一种分泌抗i群8b型禽腺病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为cctcc
2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的抗i群8b型禽腺病毒单克隆抗体。
3.权利要求2所述的抗i群8b型禽腺病毒单克隆抗体在如下至少一种中的应用；
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的产品为试剂盒。
5.一种产品，其包括权利要求2所述的抗i群8b型禽腺病毒单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：所述产品具有检测i群8b型禽腺病毒的功能。
7.根据权利要求5或6所述的产品，其特征在于：所述产品为试剂盒。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于：所述的试剂盒中包括抗i群8b型禽腺病毒的单克隆抗体，fitc标记的羊抗鼠二抗，样品稀释液和洗涤液。
9.一种非诊疗目的的检测i群8b型禽腺病毒的间接免疫荧光检测方法，其特征在于，以权利要求2所述的抗i群8b型禽腺病毒单克隆抗体作为抗体，检测待测样品中是否含有i群8b型禽腺病毒。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，向待测样品中加入抗i群8b型单克隆抗体，孵育洗涤后加入fitc羊抗鼠二抗，孵育洗涤后倒置荧光显微镜下进行观察，若细胞内出现特异性绿色荧光，则样品判为i群8a型禽腺病毒阳性，否则为阴性。
