本发明涉及生物分析，具体地，涉及一种铂类交联肽段的鉴定方法。
背景技术：
1、化学交联结合质谱技术被广泛应用于蛋白质的结构研究以及蛋白质间相互作用的解释，经典的交联质谱完整工作流程大致可以分为5个步骤：1.交联实验、2.酶切实验、3.质谱实验、4、数据解析和5.综合应用；其中交联剂的发展和交联数据的解析是化学交联结合质谱技术中最为关键的两个步骤。
2、自化学交联与质谱技术联合应用开始，围绕着交联剂和交联质谱数据解析软件的创新和发展是推动领域变革的源泉。在早期，交联数据的解析主要依赖一级质谱鉴定实现，随着交联剂的发展，逐渐出现了一些与交联剂相适配的鉴定软件，如与pir交联剂适配的blinks软件等等；随后开放式搜索算法的出现极大地支撑了不可断裂交联剂的鉴定；与此同时质谱可断裂交联剂的出现也催生了依靠特征峰离子鉴定的搜索引擎的发展。
3、目前，支持不可断裂交联剂鉴定的搜索有plink2，支持可断裂交联剂鉴定的交联剂鉴定的搜索引擎有metamorpheus，这些软件均以发展的先谷底成熟且稳健。经典的交联剂如质谱不可断裂交联剂dss和质谱可断裂交联剂dsso，这两种交联剂的性质稳定且易于检索，但是其靶向结构较少，数据密度较为稀疏；同时也存在一些非特异性交联剂如光反应交联剂，但是非特异性交联剂靶向所有氨基酸的性质所导致的更加复杂的交联产物、更加爆炸增长的数据库搜索需求和假阳性数据的排除问题也同样限制了发展。
4、铂类药物是一类基于dna酶抑制剂的抗肿瘤药物，其中已有研究发现pt(ii)类能够作为蛋白交联剂使用，并且具有许多独特的性质和优势；首先，pt(ii)对于含硫、含氮和含有羧基或羟基的氨基酸配体具有很强的结合亲和力，因此pt(ii)能够与许多不同类型的氨基酸发生反应，如甲硫氨酸(met)、半胱氨酸(cys)、组氨酸(his)、天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)、精氨酸(arg)、赖氨酸(lys)、酪氨酸(tyr)、丝氨酸(ser)和苏氨酸(thr)，这一性质能够大大提高交联数据密度和结构鉴定的信息丰富度；其次，pt(ii)带有2个固有的正电荷，更高的电荷态不仅有助于利用电荷筛选等非实验方式来富集交联肽段，并且其二次质谱碎裂模式更加全面，极大地辅助了交联位点的鉴定；同时pt(ii)具有特殊的质谱同位素峰分布，能够作为一种识别特征，使得含铂肽段的可视化鉴定、利用软件提取含金属同位素峰的交联肽段以及利用同位素匹配辅助排除假阳性成为可能；并且pt(ii)及其类似物不仅能够交联dna，还能够教练蛋白质与rna，且其交联臂长度通常在2a到5a直接，有助于提供高分辨率的精细结构、绘制柔性区域动态和描述相互作用。因此将pt(ii)类小分子作为信息金属交联试剂不仅有助于蛋白质的结构与相互作用研究，并且能够补充揭示其作为抗癌药物的毒性和耐药性机制，为临床研究提供数据支持和指导。尽管pt(ii)的交联能力已经被许多研究证明，然而利用铂类交联试剂所捕获的蛋白质精细结构和柔性区域，因缺乏适配于含铂交联数据的分析软件很少被报道。
5、由于铂类交联试剂所带有的金属配位键的键能介于非共价键和肽键共价键之间，因此起会在串联质谱中生成质谱可断裂和质谱不可断裂等多种类型碎片离子，基于此，针对不可断裂交联剂设计的搜索引擎如plink2等，无法全面匹配出由含pt(ii)交联肽段的断裂所产生的碎片例子；同时针对质谱可断裂交联剂设计的搜索引擎如maxlynx等在肽段搜索依赖于键能很低的交联剂的断裂而产生的碎片离子峰，而铂类交联剂的金属配位键的键能仅仅略低于肽键共价键，这也导致针对质谱可断裂交联剂设计的搜索引擎无法识别铂类交联肽段的特征碎片离子，进而导致铂类交联肽段无法被准确鉴定并实现交联位点的精准定位。
6、因此，目前急需一种能够准确鉴定铂类交联肽段的方法，并实现对铂类交联肽段交联位点的精准定位，进而实现蛋白质结构的精细结构解析、蛋白质间相互作用的阐释以及铂类药物的耐药性和毒性研究。
技术实现思路
1、本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种铂类交联肽段的鉴定方法。
2、本发明的第一目的是提供一种铂类交联肽段的鉴定方法。
3、本发明的第二目的是提供上述鉴定方法在鉴定铂类交联肽段中的应用。
4、本发明的第三目的是提供上述鉴定方法在定位铂类交联肽段的交联位点中的应用。
5、本发明的第四目的是提供上述鉴定方法在解析蛋白质结构中的应用。
6、本发明的第五目的是提供上述鉴定方法在指导铂类药物的耐药性和/或毒性研究中的应用。
7、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
8、一种铂类交联肽段的鉴定方法，包括以下步骤：
9、s1.将铂类交联剂和蛋白质进行交联并酶切，得到各候选铂类交联蛋白并进行质谱检测，得到各候选铂类交联肽段的谱图数据；
10、s2.将步骤s1得到的各候选铂类交联肽段的谱图数据输入至plink2软件中进行鉴定，得到各候选铂类交联肽段的α肽段和β肽段，并匹配出各候选铂类交联肽段的碎片离子y离子和b离子，以及质谱不可断裂的铂类交联肽段碎片离子y离子和b离子；
11、s3.将步骤s2得到的各候选铂类交联肽段的α肽段和β肽段分别输入ms2-autoassign-pt中，通过同位素匹配去除假阳性数据后得到各筛选后铂类交联肽段，并鉴定出各筛选后铂类交联肽段的α肽段和β肽段的质谱可断裂的碎片离子y’离子和b’离子，以及步骤s1所示铂类交联剂侧链断裂的碎片离子1；
12、所述假阳性数据为：同位素匹配结果中少于2个带有3根含铂同位素峰的碎片离子的候选铂类交联肽段；
13、s4.将步骤s3得到的各筛选后铂类交联肽段的α肽段和β肽段同时输入ms2-autoassign-pt中进行鉴定，得到各筛选后交联肽段的α肽段和β肽段均发生断裂的碎片离子y”离子和b”离子，以及步骤s1所示铂类交联剂侧链断裂的碎片离子2；
14、s5.合并步骤s2得到的y离子、b离子、y离子、b离子、步骤s3得到的y’离子、b’离子、碎片离子1、步骤s4得到的y”离子、b”离子和碎片离子2，得到各筛选后铂类交联肽段的碎片离子库；
15、s6.去除步骤s3得到的各筛选后铂类交联肽段中不符合条件的肽段，得到铂类交联肽段；
16、所述条件为：各筛选后铂类交联肽段至少含有4个步骤s5得到的碎片离子库中的碎片离子。
17、优选地，步骤s1中所述铂类交联剂为顺式铂类交联剂和/或反式铂类交联剂；
18、所述顺式铂类交联剂的化学式如式i所示，所述顺式铂类交联剂的化学式如式ii所示；
19、
20、
21、其中r1和r2为惰性基团，x1和x2为活性基团。
22、优选地，所述惰性基团为氨基配体、烷基配体、含硫配体、环状胺配体、芳香配体和/或杂环配体；活性基团为卤素离子、水基团、有机酸根、氢氧根和/或烷氧基酸。
23、更优选地，所述铂类交联剂为反铂。
24、优选地，步骤s1中所述将铂类交联剂和蛋白质进行交联具体为：
25、将蛋白质与铂类交联剂在25℃～37℃进行交联反应，接着利用猝灭剂猝灭反应。
26、更优选地，在37℃进行交联反应。
27、进一步优选地，交联反应的时间为10～60min。
28、更一步优选地，交联反应的时间为60min。
29、更优选地，所述猝灭剂为组氨酸。
30、优选地，步骤s1中所述酶切具体为：利用尿素对铂类交联剂和蛋白质交联得到的铂类交联蛋白变性，并使用胰蛋白酶进行酶切后。
31、优选地，步骤s2中所述plink2软件的参数设置为：
32、crosslinker：pt1n2h4、pt1n1h1、pt1h-2；
33、flow type：conventional crosslinking(hcd)；
34、precursor ion mass tolerance：±1～±20ppm；
35、fragment tolerance：±1～±20ppm；
36、enzymatic specificity：trypsin kr_c；semi-specific；
37、variable modification：oxidation(m)；
38、filter tolerance：±1～±20ppm；
39、the false discovery rate(fdr)：100％。
40、优选地，步骤s3中所示ms2-autoassign-pt的参数设置为：formula of labeling：pt1n2h4、pt1n1h1、pt1h-2；tolerance in ppm：1～50；intensity cutoff％：1％～10％。
41、优选地，步骤s4中所示ms2-autoassign-pt的参数设置为：formula of labeling：pt1n2h4、pt1n1h1、pt1h-2；tolerance in ppm：1～50；intensity cutoff％：1％～10％。
42、优选地，还包括步骤s7：基于步骤s5得到的各筛选后铂类交联肽段的碎片离子库定位步骤s6得到的铂类交联肽段的交联位点。
43、本发明所述鉴定方法充分考虑了铂类交联肽段在质谱过程中产生的各种类型碎片离子，包括质谱不可断裂的碎片离子、质谱可断裂的碎片离子、α肽段和β肽段均发生断裂的碎片离子以及铂类交联剂侧链断裂生成的碎片离子，综合上述碎片离子对交联质谱得到的候选铂类交联肽段进行筛选，进而得到铂类交联肽段，实现了对铂类交联肽段的精准鉴定；同时基于碎片离子对铂类交联肽段的交联位点实现精准定位，进而确定铂类交联位点的交联位点。
44、本发明还请求保护上述任一所述的鉴定方法在鉴定铂类交联肽段中的应用。
45、本发明还请求保护上述任一所述的鉴定方法在定位铂类交联肽段的交联位点中的应用。
46、本发明还请求保护上述任一所述的鉴定方法在解析蛋白质结构中的应用。
47、本发明还请求保护上述任一所述的鉴定方法在指导铂类药物的耐药性和/或毒性研究中的应用。
48、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
49、本发明提供了一种铂类交联肽段的鉴定方法，通过对铂类交联剂和蛋白质进行交联并酶切得到的各候选铂类交联肽段进行质谱鉴定，得到各候选铂类交联肽段的谱图数据，并基于各候选铂类交联肽段的谱图数据获取质谱不可断裂的碎片离子、质谱可断裂的碎片离子、α肽段和β肽段均发生断裂的碎片离子以及铂类交联剂侧链断裂生成的碎片离子，对各候选铂类交联肽段进行筛选得到铂类交联肽段，实现了对铂类交联肽段的精准鉴定；同时基于碎片离子对铂类交联肽段的交联位点实现精准定位。利用本发明所示鉴定方法既能够鉴定得到更多数量的铂类交联肽段，同时还能保证对铂类交联肽段的准确鉴定，并且还能够准确定位铂类交联肽段的交联位点，进而实现蛋白质结构的解析以及指导铂类药物的耐药性和/或毒性研究。
1.一种铂类交联肽段的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，步骤s1中所述铂类交联剂为顺式铂类交联剂和/或反式铂类交联剂；
3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤s1中所述铂类交联剂为反铂。
4.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，步骤s1中所述将铂类交联剂和蛋白质进行交联具体为：
5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，所述猝灭剂为组氨酸。
6.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，步骤s3中所示ms2-autoassign-pt的参数设置为，formula oflabeling：pt1n2h4、pt1n1h1、pt1h-2；tolerance in ppm：1～50；intensity cutoff％：1％～10％。
7.权利要求1～6任一所述的鉴定方法在鉴定铂类交联肽段中的应用。
8.权利要求1～6任一所述的鉴定方法在定位铂类交联肽段的交联位点中的应用。
9.权利要求1～6任一所述的鉴定方法在解析蛋白质结构中的应用。
10.权利要求1～6任一所述的鉴定方法在指导铂类药物的耐药性和/或毒性研究中的应用。
