本发明涉及生物医药，更具体的说是涉及一种抗肿瘤蛤蜊肽的制备方法和应用。
背景技术：
1、癌症不仅仅是一系列生物学事件的结果，而是一个复杂的、多因素驱动的疾病过程。它涉及肿瘤细胞、肿瘤微环境(tumor microenvironment,tme)、宿主代谢和免疫系统等多个方面的相互作用。这些因素共同作用，影响癌症的发生、发展和治疗响应。tme是免疫细胞和癌细胞相互作用的关键场所，是肿瘤生存、发展和免疫逃避的肥沃土壤。免疫反应是机体抵抗肿瘤的天然屏障，免疫效应失衡是肿瘤发生和发展的主要原因。免疫系统在癌症中发挥着双重作用：一方面，它是抵御肿瘤细胞的守护者，另一方面，癌症细胞能够操纵免疫系统以促进自身的存活。
2、结直肠癌是临床上常见的恶性肿瘤，好发于中老年人群，呈逐年上升的趋势。由于结直肠癌患病早期缺乏特异性症状，导致早期诊断率较低，多数患者在确诊时已发展至中晚期，增加了根治性手术的治疗难度，影响病情预后，严重影响患者生存寿命。手术是目前治疗结直肠癌的主要措施，适用于早、中期患者，术后结合放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗及中医药治疗等综合治疗；而晚期患者手术疗效较差，且对机体免疫功能影响较大，导致消化系统、免疫系统等出现明显的不良反应，严重影响结直肠癌患者的生活质量。
3、巨噬细胞是高度可塑性的天然免疫细胞，也是tme的主要组成部分，是机体长期保持自身免疫平衡状态的最主要原因。研究表明，食物来源的免疫活性肽可以刺激免疫系统消除入侵者、修复身体损伤和提高免疫力。报道指出，多种食物来源的肽类在体外和动物实验中具有免疫增强、调节作用，从鲑鱼、文蛤和鸡蛋等食物中获得活性肽主要是通过提高raw264.7巨噬细胞的吞噬能力、一氧化氮(nitric oxide，no)产生量、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，inos)表达量、胞内活性氧(reactive oxygen species，ros)生成量和细胞因子分泌量来发挥免疫调节作用。此外，与药物相比，食物来源的免疫活性肽具有无毒、更易吸收且免疫原性更低的优势。
4、菲律宾蛤仔是重要的优质海洋资源，具有肉质鲜美、营养价值丰富、高蛋白且低脂肪等特点，含有丰富的多肽、多糖、糖胺聚糖等生理活性物质。研究表明，蛤蜊肽属海洋源的小分子生物活性肽，安全性高，易被吸收，抗氧化、抗炎、抗细菌和调节血糖及血脂等多种生物活性。海洋源的蛤蜊活性肽目前已成为研究的热点，关于蛤蜊肽的抗肿瘤及其免疫调节活性功能研究却鲜见报道。
5、经过检索发现，有两篇与本专利申请相关的公开专利文献：(1)“一种抗炎护肾的蛤蜊肽的制备方法和应用”(cn202110997320.9)，提供了一种蛤蜊肽在缓解高血压引起的肾功能损伤的药物中的应用。属蛤蜊肽在抗炎护肾领域的功能应用。(2)“血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法和应用”(cn201310212991.5)提供了一种蛤蜊肽在抑制血管紧张素转化酶方面的应用及其制备方法。属蛤蜊肽在降血压领域的功能应用。
6、通过对比，上述公开专利文献的技术方案及应用领域与本专利有本质不同，且目前尚未有蛤蜊肽在抗肿瘤及其免疫调节功能方面的应用，尤其是没有对结直肠原位瘤的直接抑制作用和增强免疫力的抗肿瘤活性。
7、因此，提供一种抗肿瘤蛤蜊肽的制备方法和应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了一种抗肿瘤蛤蜊肽的制备方法和应用，填补了抗肿瘤蛤蜊肽的制备和应用空白。
2、本发明的目的在于采用红岛蛤蜊(菲律宾蛤仔)制备蛤蜊肽，将其用于抑制肿瘤细胞和调节机体免疫功能。并进一步应用到其他肿瘤的治疗，以及辅助增强机体免疫调节能力和细胞损伤修护。
3、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
4、一种抗肿瘤蛤蜊肽的制备方法，具体步骤如下：
5、(1)以菲律宾蛤仔整肉为原料，清洗后加纯水匀浆，得到原料：纯水＝1：2～3的蛤蜊肉浆，调节其ph为7.8～8.5，设定酶解温度为37～38℃，加入原料重量0.03％～0.05％的胰蛋白酶，酶解3～5h后，进行酶灭活处理，得到酶解液；所述胰蛋白酶酶活力为2500u；
6、(2)将步骤(1)所得酶解液离心，弃沉淀，上清液经过10μm微滤膜-50000da超滤膜-400da纳滤膜过滤，截取400da到50000da分子量之间的酶解液；经喷雾干燥制得蛤蜊肽(粉)，其纯度达到70％及以上(以多肽含量计)，相对分子质量小于5000da的肽所占比例达到97％及以上。
7、进一步，步骤(1)所述酶灭活处理为80～100℃处理15～20min。
8、进一步，步骤(2)所述离心为5000rpm离心20min。
9、进一步，所述的制备方法制备得到的蛤蜊肽。
10、进一步，所述的蛤蜊肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
11、进一步，所述肿瘤为结肠直肠癌。
12、进一步，所述的蛤蜊肽在制备免疫调节药物中的应用。
13、进一步，所述药物为口服、注射或外用剂型。
14、采用胰蛋白酶-膜耦合技术，通过酶解、离心、纯化、干燥等加工技术生产的一种色泽、口感具佳，具有抗肿瘤和增强免疫功能，且易于人体吸收的蛤蜊肽粉，可用于抗肿瘤药物及增强免疫力的肿瘤治疗相关功能的产品的制备，以实现蛤蜊肉的高值化利用。
15、为了弄清蛤蜊肽粉中活性肽的氨基酸序列，将蛤蜊肽粉(400-50000da)溶于适量纯净水中，用超滤仪过5000da超滤膜得到400-5000da和5000-50000da两个组分：组分1(400da-5000da)、组分2(5000-50000da)。收集两个组分进行sephadex凝胶过滤层析，将对人结肠癌细胞ht-29增殖抑制率较高组分通过lc-ms/ms进行氨基酸序列鉴定。通过与蛋白质数据库比较鉴定出10个肽段：iivdelk，vfpsrr，alflk，ilfir，vvtavk，eiaqdfk，rligr，ltgmafr，vflenvir，vldsqkk。
16、本发明中所述的蛤蜊肽在斑马鱼肿瘤移植模型体内发挥良好的抑制肿瘤细胞生长和转移、促进肿瘤细胞凋亡和抑制血管新生效果，同时能上调bax、ifng1和tnf-α基因表达，下调vegfaa基因表达。
17、本发明中所述的蛤蜊肽在结直肠炎症原位肿瘤模型小鼠体内发挥良好的抗肿瘤作用和调节免疫效应。有效缓解了结直肠病变症状，同时显著降低il-1β、cea、lps含量等，显著降低因肿瘤导致的cox-2、ki67和pcna的高表达，有效抑制肿瘤的扩散和生长。
18、本发明中所述的蛤蜊肽应用不仅局限于结肠直肠癌抑制肿瘤、辅助治疗和免疫力调节，也适用于其他肿瘤抑制和辅助治疗及提高机体免疫力。
19、本发明中所述的蛤蜊肽可用于抗肿瘤药物及提高免疫力功能药物的制备，且可以为药剂学上允许的任何剂型，包括口服(粉剂、片剂、胶囊、口服液等)、注射和外用剂型。
20、本发明中所述的蛤蜊肽可作为直接抗肿瘤的治疗药物，及增强免疫力、辅助肿瘤治疗的相关产品中的组成成分。
21、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种抗肿瘤蛤蜊肽的制备方法和应用，具有以下有益效果：
22、(1)本发明的蛤蜊肽通过试验证实具有显著的抑制肿瘤细胞生长、转移，促进细胞凋亡，抑制血管新生的功效，同时能上调bax、ifng1和tnf-α基因表达，下调vegfaa基因表达。
23、(2)本发明的蛤蜊肽通过试验证实具有良好的缓解结直肠癌变的症状，能够释放众多的抗肿瘤因子，有效抑制肿瘤的扩散和生长，同时降低因肿瘤导致的cox-2、ki67和pcna等的高表达。
24、(3)本发明开拓了蛤蜊肽新的医疗和保健用途，具有安全性高、易被吸收的特点，为广大患者提供了一种抗肿瘤和调节免疫功能的食源性药物选择。
1.一种抗肿瘤蛤蜊肽的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤蛤蜊肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述酶灭活处理为80～100℃处理15～20min。
3.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤蛤蜊肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述离心为5000rpm离心20min。
4.权利要求1-3任一项所述的制备方法制备得到的蛤蜊肽。
5.权利要求4所述的蛤蜊肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为结肠直肠癌。
7.权利要求4所述的蛤蜊肽在制备免疫调节药物中的应用。
8.根据权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于，所述药物为口服、注射或外用剂型。
