本发明涉及生物医药，特别涉及一种锰铜双金属络合物纳米酶的制备方法及其在缓解动物炎症性肠病中的应用。
背景技术：
1、症性肠病(ibd)是一种主要的胃肠道疾病,包括克罗恩病(cd)和溃疡性结肠炎(uc),它以胃肠道组织的慢性炎症为特征,可引起肠道微生物失衡，肠道黏膜屏障受损，免疫功能下降，对人类健康造成极大威胁。炎症从本质上来说是机体的一种防御性反应，这种防御反应主要是活体组织对损伤因子而产生的，是机体的一种自我防御。在许多研究中已经发现炎症发生的因素很广，比如发生病原体感染、过敏源的长时间刺激、电离辐射等。
2、一般而言，电离辐射或者化学品等外源都能够导致细胞内的ros出现或蓄积。活性氧(reactive oxygen species,ros)一般主要指生物体的细胞进行呼吸作用时，在生物体的代谢过程中所出现的超氧自由基、羟自由基、过氧化氢以及臭氧等含氧原子的单电子产物。过剩的ros能够直接对核糖核酸，蛋白质等进行攻击，使得肠道组织细胞大量死亡，进而促进ibd的进展及其严重程度。目前，抗生素、氨基水杨酸盐、皮质类固醇等药物可以减轻炎症，修复肠屏障。但由于药物无法在结肠上形成特异性的靶向治疗，导致药物不能有效地输送到炎症区域，从而降低药物的疗效，对其他器官产生不良反应。因此，探索适用于体内的sod人工酶的兴趣越来越大。纳米酶作为一种新型的人工酶，不仅能表现出纳米材料的独特性质，还能模拟天然酶的多种活性。更重要的是，一些研究表明，通过适当的策略可以获得具有sod样活性的纳米酶，抗炎疗法的新选择。然而，具有类sod活性的纳米酶的应用仍面临着生物相容性差、对酸的耐受性弱、催化活性不尽如人意等诸多限制。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种锰铜双金属络合物纳米酶的制备方法及其在缓解动物炎症性肠病中的应用，本发明通过杨梅素对锰金属和铜金属进行络合，通过简单的沉淀反应制备了锰铜双金属络合物纳米酶，再使用tpp对纳米酶进行封装，得到具有靶向功能的锰铜双金属络合物纳米酶；本发明公开的锰铜双金属络合物纳米酶拥有超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶多种模拟酶活性；采用该纳米酶可以有效的清除细胞或者体内ros，从而减轻病变部位的炎症，同时促进抗炎免疫反应，对治疗炎症性肠病ibd具有重要意义，特别是，锰铜双金属络合物纳米酶可以用于小鼠溃疡性结肠炎的靶向治疗，具有极好的应用前景。
2、本发明的锰铜双金属络合物纳米酶比非催化抗氧化剂更有效地清除活性氧(ros)，同时比游离酶更稳定；采用三苯基磷tpp对mncu-myr纳米颗粒进行包覆，以提高其靶向性、生物相容性和耐酸性，从而降低了其潜在的纳米毒性；口服给药时，mncu-myr@tpp在胃中是稳定的，在结肠病变处可清除多余的ros，从而减轻病变部位的炎症，同时促进抗炎免疫反应，并最终有效治疗小鼠模型中右旋糖酐硫酸钠(dss)诱导的ibd。为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种基于双金属络合物纳米酶的制备方法，该方法操作简单，成本低，有望用于工业化生产。
3、为实现以上技术效果，采用如下技术方案：
4、一种锰铜双金属络合物纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
5、步骤s1：将四水醋酸锰和乙酸铜溶解在乙醇水溶液中，并在室温下搅拌；随后加入pvp，增强其水溶性，得到混合液a；
6、步骤s2：将杨梅素加入到乙醇水溶液中，调节ph，室温搅拌，得到混合液b；
7、步骤s3：将混合液a和混合液b依次倒入反应容器中，水浴加热反应；待反应结束后，降至室温；将所得溶液离心后经过多次水洗，离心，得到棕黄色沉淀；将棕黄色沉淀在真空冷冻干燥机中干燥，得到mncu-myr配合物纳米酶；
8、步骤s4：将tpp分散在pbs缓冲溶液中，然后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺edc和n-羟基磺基琥珀酰亚胺nhs，以活化tpp的羧基；将tpp、edc和nhs的混合物在搅拌下室温反应；产物用透析袋纯化，然后冻干，得到纯净tpp；
9、步骤s5：将步骤s3中得到的mncu-myr配合物纳米酶溶解在水溶液中，添加步骤s4中得到的tpp，室温搅拌，离心，甲醇洗涤，真空干燥，得到具有靶向功能的锰铜双金属络合物纳米酶。
10、进一步的，所述四水醋酸锰、乙酸铜、pvp和杨梅素的质量比为40-45：6-8：40-45：9-10。
11、进一步的，所述步骤s1中室温下搅拌1-2h；所述步骤s2中调节ph至7.0-7.4；室温搅拌1-2h。
12、进一步的，所述步骤s3中水浴加热至65℃-75℃，反应持续7h-8h；将所得溶液在4000-4200rpm下离心10-15min，经过多次水洗，离心，得到棕黄色沉淀，真空冷冻干燥机中干燥24-48h。
13、进一步的，所述步骤s4中tpp、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺edc和n-羟基磺基琥珀酰亚胺nhs的质量比为4-4.2：2-2.2：1-1.2。
14、进一步的，所述步骤s4中pbs缓冲溶液组分为na2hpo4、kh2po4、nacl和kcl；pbs缓冲溶液ph为7-7.4。
15、进一步的，所述步骤s4中tpp、edc和nhs的混合物在搅拌下室温反应16-18h；产物用500-1000da透析袋纯化24-48h。
16、进一步的，所述步骤s4中mncu-myr配合物纳米酶和tpp的质量比为5-5.5：2-2.5；室温搅拌20-24h，4000-4200rpm离心10-15min，甲醇洗涤3-5次。
17、一种锰铜双金属络合物纳米酶，采用上述任意一项制备方法制备得到。
18、所述锰铜双金属络合物纳米酶用于缓解动物炎症性肠病中的靶向治疗应用。
19、本发明的有益效果为：
20、(1)本发明的纳米酶制备方法简单，无需复杂的仪器设备，成本低，有望用于工业化生产；
21、(2)本发明的口服靶向纳米药物，通过络合作用将杨梅素和双金属进行协同增效作用，能有效的清除细胞或者体内ros，从而减轻病变部位的炎症，同时促进抗炎免疫反应，对治疗炎症性肠病(ibd)具有重要意义。
22、(3)本发明的口服纳米药物，通过口服给药的方式可以减小纳米材料潜在的毒性，tpp包封后可以减小胃肠道的吸收从而到达结肠部位，该纳米药物对正常细胞具有较低的毒性，且生物相容性好。
1.一种锰铜双金属络合物纳米酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
2.如权利要求1中所述的一种锰铜双金属络合物纳米酶的制备方法，其特征在于，所述四水醋酸锰、乙酸铜、pvp和杨梅素的质量比为40-45：6-8：40-45：9-10。
3.如权利要求1中所述的一种锰铜双金属络合物纳米酶的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中室温下搅拌1-2h；所述步骤s2中调节ph至7.8-8.0；室温搅拌1-2h。
4.如权利要求1中所述的一种锰铜双金属络合物纳米酶的制备方法，其特征在于，所述步骤s3中水浴加热至65℃-75℃，反应持续7h-8h；将所得溶液在4000-4200rpm下离心10-15min，经过多次水洗，离心，得到棕黄色沉淀，真空冷冻干燥机中干燥24-36h。
5.如权利要求1中所述的一种锰铜双金属络合物纳米酶的制备方法，其特征在于，所述步骤s4中tpp、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺edc和n-羟基磺基琥珀酰亚胺nhs的质量比为4-5：2-3：1-2。
6.如权利要求1中所述的一种锰铜双金属络合物纳米酶的制备方法，其特征在于，所述步骤s4中pbs缓冲溶液组分为na2hpo4、kh2po4、nacl和kcl；pbs缓冲溶液ph为7-7.4。
7.如权利要求1中所述的一种锰铜双金属络合物纳米酶的制备方法，其特征在于，所述步骤s4中tpp、edc和nhs的混合物在搅拌下室温反应16-18h；产物用500-1000da透析袋纯化24-48h。
8.如权利要求1中所述的一种锰铜双金属络合物纳米酶的制备方法，其特征在于，所述步骤s4中mncu-myr配合物纳米酶和tpp的质量比为5-6：2-3；室温搅拌20-24h，4000-4200rpm离心10-15min，甲醇洗涤3-5次。
9.一种锰铜双金属络合物纳米酶，其特征在于，采用权利要求1-8中任意一项制备方法制备得到。
10.如权利要求9所述的一种锰铜双金属络合物纳米酶，其特征在于，所述锰铜双金属络合物纳米酶用于缓解动物炎症性肠病中的靶向治疗应用。
