本发明涉及生物技术、植物病害防治技术、基因工程，尤其涉及敲除mir399d基因在正向调控水稻抗水稻锯齿叶矮缩病毒的应用。
背景技术：
1、水稻锯齿叶矮缩病毒(rice ragged stunt virus,rrsv)是影响水稻生产、产量和品质的重要因素之一，其会造成巨大的农业经济损失。而rrsv主要通过褐飞虱(nilarparvata lugens)传播，其会导致水稻植株矮化、分蘖增多、叶片黄化及产量下降，严重时可能导致植株死亡。由于褐飞虱的广泛分布和强大的迁移能力，使得rrsv防控极为困难。传统技术上，使用化学农药控制褐飞虱数量是主要手段，但化学防治不仅加剧了褐飞虱对药物的抗性，还引起了环境污染和生态平衡的破坏。因此，开发新型、环境友好的防治策略成为当务之急。
2、近年来，生物技术和分子生物学的快速发展，为深入理解rrsv的致病机制及宿主植物的防御机制提供了新的工具和方法。通过对rrsv的结构特点和遗传特性的详细分析，科研人员已揭示其复杂的致病过程和与宿主相互作用的分子机制。例如，对rrsv双层外壳结构的研究，为探究其侵染途径和复制机制奠定了基础。这些研究不仅加深了我们对病毒生物学的了解，而且为开发针对性的防控措施提供了科学依据。目前，通过基因工程技术培育抗病毒特性的水稻品种成为研究焦点，这种策略通过增强水稻的内在抗病力，从根本上减少病毒病害的发生，为可持续水稻生产提供了新策略。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的在于提出一种实施可靠、实施效果佳的敲除mir399d基因在正向调控水稻抗水稻锯齿叶矮缩病毒的应用。
2、为了实现上述的技术目的，本发明所采用的技术方案为：
3、敲除mir399d基因在正向调控水稻抗水稻锯齿叶矮缩病毒的应用，所述mir399d基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
4、seq id no.1:
5、acagtagtaggcagctctcc
6、作为一种可能的实施方式，进一步，本方案所述应用包括：
7、在mir399d基因的前体序列设计crispr靶点，对mir399d基因进行敲除；
8、所述mir399d基因的前体序列的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9、seq id no.2:
10、aagacagtagtaggcagctctcctctggcaggtgcattctaggtgattttgtaattgtatatgcatccaaggtatatacagtccggccatggtgctacattgcaatcatccatatgtgattgcattgtgtatatatatacatggtggcctttgatagaccatcatatatcggttggttatgtgcatgtatgtatataccagctgctactagctttgatcgatcgccatgtagcgattgaattcaccaaaacggcctgccaaaggagagttgccctgcgactgtctt
11、作为一种较优的实施选择，优选的，本方案所述应用包括：
12、s01、在mir399d基因的前体序列设计crispr靶点，通过crispr-cas9系统设计用于敲除mir399d基因的敲除载体；
13、s02、将敲除载体转化到农杆菌eha105中，然后将农杆菌eha105调成悬浮液，令其侵染水稻种子的愈伤组织中，再将其培养成带有芽的植株，然后对其进行筛选，以获得mir399d基因敲除的t0代水稻植株。
14、作为一种较优的实施选择，优选的，本方案s02还包括：使用ctab法从t0代植株中提取基因组dna，针对每个目标基因的特定靶点进行pcr扩增，并对扩增的片段进行测序以确认基因敲除的成功，从而筛选获得mir399d基因敲除的水稻植株。
15、作为一种较优的实施选择，优选的，本方案还包括：s03、在水稻植株生长培养过程中加入含磷营养液。
16、作为一种较优的实施选择，优选的，本方案所述水稻的品种包括中花11号。
17、采用上述的技术方案，本发明与现有技术相比，其具有的有益效果为：本方案基于对rrsv和水稻mir399d基因功能的深入研究，旨在提供一种新的有效防治策略，以增强水稻对rrsv的抗性。通过研究发现，水稻mir399d基因在水稻对rrsv抗性中发挥着关键的生物学功能，高磷(hp)环境中，mir399d基因敲除的转基因材料与对照品种相比接种rrsv后对磷的敏感性降低更能抵抗rrsv侵染。因此，本方案通过操控水稻mir399d基因表达(即干扰mir399d基因的正常功能，进而影响水稻的抗病毒能力)，从而增强水稻对rrsv侵染的抵抗力。
18、除此之外，本方案有益效果还包括如下：
19、提出了水稻抗病机制的新理解：本方案揭示了高磷处理环境中，敲除mir399d基因的水稻对rrsv的抵抗力增强。这一发现为水稻病毒的有效防治提供了新的分子机制，扩展了本领域对植物病理学的理解。
20、本方案提出了新的防治策略：本方案通过农杆菌介导的遗传转化技术引入突变的mir399d基因(即表达干扰或沉默)，为水稻提供了一种新的抗病毒策略。这种方法显著提高了水稻对rrsv的抗性，为控制和减轻由此病毒引起的病害提供了有效手段。
1.敲除mir399d基因在正向调控水稻抗水稻锯齿叶矮缩病毒的应用，其特征在于，所述mir399d基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.如权利要求1所述的敲除mir399d基因在正向调控水稻抗水稻锯齿叶矮缩病毒的应用，其特征在于，所述应用包括：
3.如权利要求2所述的敲除mir399d基因在正向调控水稻抗水稻锯齿叶矮缩病毒的应用，其特征在于，所述应用包括：
4.如权利要求3所述的敲除mir399d基因在正向调控水稻抗水稻锯齿叶矮缩病毒的应用，其特征在于，s02还包括：
5.如权利要求4所述的敲除mir399d基因在正向调控水稻抗水稻锯齿叶矮缩病毒的应用，其特征在于，其还包括：
6.如权利要求1至5之一所述的敲除mir399d基因在正向调控水稻抗水稻锯齿叶矮缩病毒的应用，其特征在于，所述水稻的品种包括中花11号。
