本发明涉及微生物制药及医药化工，尤其涉及一种重组菌的构建及其制备醋酸泼尼松的方法。
背景技术：
1、甾体类药物是指分子结构中含有典型甾体结构的药物，主要包括肾上腺皮质激素、性激素和蛋白同化激素三大类，作为目前临床上用量仅次于抗生素的第二类药物，全球年产量已超过100万吨。甾体化合物的微生物转化是指利用微生物细胞或者其体内的酶选择性地修饰或改造甾体化合物的某一特定部分(基团)，从而获得结构上类似但生理活性提高的化合物或中间体。
2、醋酸泼尼松(分子式c23h28o6，化学名为：17α,21-二羟基孕甾-1,4-二烯-3,11,20-三酮-21-醋酸酯)是一类重要的肾上腺皮质激素类药，具有影响糖代谢、抗炎、抗过敏、抗毒性等作用。主要生产工艺是：先将含有重组ksdd5酶的菌体进行发酵培养，再以醋酸可的松为底物，添加发酵离心所得的菌体并以细胞内的辅酶fad作为电子受体，额外添加的pms作为电子传递链组分进行c1、c2位脱氢后得到醋酸泼尼松，其技术路线如下：
3、
4、专利号为cn114807286a的发明专利公开了一种基于静息细胞转化精制醋酸泼尼松的方法，该方法使用静息细胞进行醋酸泼尼松的制备，但底物投料量低，仅为20-40g/l，而且转化时间较长，需要转化2～3d。为此需要一种能在高底物投料量，低酶用量，转化时间短的高效率方法。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提出了一种高底物投料量，低酶用量，转化时间短的重组菌的构建及其制备醋酸泼尼松的方法。
2、本发明的技术方案是这样实现的：一方面，本发明提供了一种重组菌的构建方法，包括以下步骤：
3、s1，扩增sumo蛋白基因和ksdd5蛋白酶基因，然后将pet28a质粒酶切后与sumo基因和ksdd5基因无缝连接，获得重组质粒pet28a-sumo-ksdd5；
4、s2，将重组质粒pet28a-sumo-ksdd5转化至大肠杆菌bl21感受态细胞，培养后得到重组菌。
5、本发明将sumo基因与ksdd5连接于pet28a(+)质粒上，得到重组脱氢酶质粒，随后进行融合表达，可利用细胞本身的fad辅酶再生体系，无需添加外源性的辅酶fad；此外sumo蛋白提高了3-甾酮-δ1-脱氢酶在大肠杆菌bl21(de3)中的溶解性，以及3-甾酮-δ1-脱氢酶在大肠杆菌bl21(de3)中的蛋白表达量，同时也提高了3-甾酮-δ1-脱氢酶ksdd5转化醋酸泼尼松的效率。
6、另一方面，本发明还提供了一种重组菌，重组菌采用上述方法构建得到，所述重组质粒pet28a-sumo-ksdd5中编码sumo-ksdd5融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7、再一方面，本发明还提供了一种重组菌在制备醋酸泼尼松中的应用，包括以下步骤：
8、s21，重组菌经发酵培养、离心后得到重组菌菌泥；
9、s22，将醋酸可的松乳化后，加入异丙醇、pms和步骤s21的重组菌菌泥，转化24h得到醋酸泼尼松。
10、在以上技术方案的基础上，优选的，所述醋酸可的松∶重组菌菌泥的质量比为1-4∶1。
11、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s22中转化反应条件为：温度30℃，转速200-400r/min，通气量0.3-0.8vvm，压力0.01-0.05mpa。
12、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s21中重组菌发酵培养方法为：重组菌二级培养后接种于含有卡那霉素的发酵培养基中，在35℃-37℃、转速600-800r/min、通气量2-3vvm条件下发酵培养，当ph降低到最低值并开始反弹8％-12％时开始添加补料培养基，培养至菌液od600值20-25时，加入0.4-0.5mm iptg诱导表达16-18h后离心，获得重组菌菌泥。
13、在以上技术方案的基础上，优选的，发酵培养基组分为：发酵培养基的组分为：甘油4-6g/l、酵母浸粉20-28g/l、胰蛋白胨15-20g/l、卡那霉素45-55μg/ml、磷酸二氢钾1-3g/l、磷酸氢二钾15-18g/l和消泡剂a2010.1v％-0.3v％。
14、在以上技术方案的基础上，优选的，补料培养基的组分为甘油55v％-65v％、磷酸氢二胺4-6g/l。
15、在重组菌高密度发酵过程中，随着细胞的增殖，发酵培养基中的营养成分逐渐消耗。补料培养基能够在细胞生长的后期及时补充消耗的养分，有助于延长细胞的生长阶段，使其维持在高活性状态。合理的补料还可以调节细胞内的代谢途径，推动更多前体物质的合成，增强目标代谢产物的生成。
16、补料培养基中的成分，如甘油和磷酸氢二胺为细胞提供了额外的碳源和氮源，能够增强细胞的代谢活性。这一增加的代谢活性对后续的目标蛋白表达、酶促反应和底物转化的效率都是十分重要的。更好的营养供给能够提高细胞的酶活性，确保在静息细胞酶促反应中，细胞能够高效地催化目标产物的合成，提升醋酸泼尼松的转化率。
17、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s22中，醋酸可的松乳化时加入助溶剂，在8000-12000r/min条件下匀浆10-15min得到乳化后醋酸可的松，微粒粒径＜90μm。
18、在以上技术方案的基础上，优选的，所述助溶剂为异丙醇，异丙醇的浓度为5v％-10v％。
19、醋酸可的松乳化时加入异丙醇助溶剂，可以增加醋酸可的松在水中的溶解度，还可以减少乳化过程中的界面张力，提高乳化效果，这使得醋酸可的松和重组菌之间形成更大的接触面积，促进了反应的进行。在生物转化过程中，酶与底物的相互作用受到溶剂环境的影响，异丙醇则在一定程度上改善了酶的活性或稳定性，增强了重组菌的催化能力，从而提高了最终产物醋酸泼尼松的转化率。
20、本发明的一种重组菌的构建及其制备醋酸泼尼松的方法相对于现有技术具有以下有益效果：
21、(1)本发明构建的重组菌在转化醋酸泼尼松时，可利用细胞本身的fad辅酶再生体系，反应体系无需添加外源性的辅酶fad，同时也提高了转化醋酸泼尼松的效率。
22、(2)高密度发酵过程中，追加补料培养基，它不仅能通过提高细胞的代谢活性、避免营养缺乏导致的抑制，还能增加最终的转化率。
23、(3)异丙醇助溶剂可以增加醋酸可的松在水中的溶解度，提高醋酸可的松的乳化效果，促进了反应的进行。此外，异丙醇在一定程度上增强了重组菌的催化能力，提高了醋酸泼尼松的转化率。
1.一种重组菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法构建得到的重组菌，其特征在于：重组质粒pet28a-sumo-ksdd5中编码sumo-ksdd5融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
3.如权利要求2所述的重组菌在制备醋酸泼尼松中的应用，其特征在于：包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述醋酸可的松∶重组菌菌泥的质量比为1-4∶1。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤s22中转化反应条件为：温度30℃，转速200-400r/min，通气量0.3-0.8vvm，压力0.01-0.05mpa。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤s21中重组菌发酵培养方法为：重组菌二级培养后接种于含有卡那霉素的发酵培养基中，在35℃-37℃、转速600-800r/min、通气量2-3vvm条件下发酵培养，当ph降低到最低值并开始反弹8％-12％时开始添加补料培养基，培养至菌液od600值20-25时，加入0.4-0.5mm iptg诱导表达16-18h后离心，获得重组菌菌泥。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：发酵培养基的组分为：甘油4-6g/l、酵母浸粉20-28g/l、胰蛋白胨15-20g/l、卡那霉素45-55μg/ml、磷酸二氢钾1-3g/l、磷酸氢二钾15-18g/l和消泡剂a2010.1v％-0.3v％。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于：补料培养基的组分为甘油55v％-65v％、磷酸氢二胺4-6g/l。
9.如权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤s22中，醋酸可的松乳化时加入助溶剂，在8000-12000r/min条件下匀浆10-15min得到乳化后醋酸可的松，微粒粒径＜90μm。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述助溶剂为异丙醇，异丙醇的浓度为5v％-10v％。
