本发明属于生物，具体涉及非天然伴侣蛋白在p450scc酿酒酵母外源表达活性提高中的应用。
背景技术：
1、p450scc由胆固醇侧链裂解酶(cholesterol side-chain cleavage enzyme)cyp11a1和其伴侣蛋白adx和adr组成，在脊椎动物中负责类固醇激素生成途径的第一步催化，即在线粒体中实现胆固醇到孕烯醇酮的生成，也是该途径中的重要限速步骤。在酿酒酵母中外源表达cyp11a1时，因为底物供给原因会选择将cyp11a1截短使其定位在胞内(duport,c.et al.,self-sufficient biosynthesis of pregnenoloneand progesteronein engineered yeast.nat biotechnol 1998,16(2),186-9.)，此时其天然伴侣蛋白adx和adr也须使用同样的截短方式定位在胞内，而截短形式的adx——tadx会因为胞内[2fe-2s]含量少而功能不佳，虽然可以考虑通过提高胞内[2fe-2s]增加p450scc的活性，但其活性还会受限于多个伴侣蛋白在胞内的定位各异(cn202211411488.8)。为了解决这个问题，希望p450的伴侣蛋白的数目越少越好，最好酶本身就可以兼顾伴侣蛋白的还原功能。
2、内质网p450的伴侣蛋白仅有一个cpr(cytochrome p450 reductases)，且不需要辅因子[2fe-2s]来帮助折叠，如果cyp11a1可以很好的利用cpr进行催化，既可以规避辅因子[2fe-2s]对cyp11a1的催化限制，又可以避免因adx和adr定位各异，接触受限而引起的电子传递效率不佳问题。针对cyp11a1能否利用cpr作为伴侣蛋白，有两种截然不同的结果：yablokov等报道btcyp11a1在体外可以和cpr蛋白互作，但两者组合并没有催化活性(yablokov,e.o.et al.,a large-scale comparative analysis of affi nity,thermodynamics and functional characteristics of interactions of twelvecytochrome p450isoforms and their redox partners.biochimie 2019,162,156-166.)，但li等报道bbgcyp11a1(bufo bufogargarizans cantor)和aacpr(anemarrhenaasphodeloides)组合能够在酿酒酵母中无adx和adr参与的情况下成功产出孕烯醇酮(li,g,et al,transcriptome analysis and identification of thecholesterol side chain cleavage enzyme bbgcyp11a1 from bufo bufogargarizans.front genet 2022,13,828877.)。
技术实现思路
1、为了验证胆固醇侧链裂解酶cyp11a1对cpr的利用情况，本实验选了4个来源的cyp11a1和4个来源的cpr，进行组合验证。其中截短的野猪来源的tsscyp11a1被证明在酵母外源表达生产孕烯醇酮时效果最佳(zhang,r.；zhang,y.；wang,y.；yao,m.；zhang,j.；liu,h.；zhou,x.；xiao,w.；yuan,y.,pregnenolone overproduction in yarrowia lipolyticaby integrative components pairing of the cytochrome p450scc system.acs synthbiol 2019,8(12),2666-2678.)，蓝色犁头霉源的aocpr在酿酒酵母全细胞催化生产氢化可的松的菌株中表现最佳(chen,j.et al,identification of absidia orchidis steroid11β-hydroxylation system and its application in engineering saccharomycescerevisiae for one-step biotransformation to produce hydrocortisone.metab eng2020,57,31-42.)。同时为了比较cyp11a1和自身伴侣蛋白adx，adr及非天然伴侣蛋白cpr电子传递效率的差异，选择截短的牛源的adx和adr作为对照。
2、其中cyp11a1的来源如下：(1)中华大蟾蜍(bufo bufogargarizans cantor)来源的bbgcyp11a1，(2)人源(homo sapiens)的hmcyp11a1，(3)牛源(bos taurus)的btcyp11a1，(4)野猪源(sus sus scrofa)的sscyp11a1。
3、cpr的来源如下：(1)葡萄源(vitis vinifera l)的vvcpr，(2)知母源(anemarrhenaasphodeloides)的aocpr，(3)蓝色犁头霉(absidiacoerulea)源的aocpr，(4)酿酒酵母自身的(saccharomyces cerevisiae)的cpr—ncp1。
4、本发明提供一种用于表达cyp11a1的重组酿酒酵母，其特征在于，其基因组上整合有cyp11a1的编码基因和cpr的编码基因。
5、具体地，所述cyp11a1是：中华大蟾蜍(bufo bufogargarizans cantor)来源的bbgcyp11a1，人源(homo sapiens)的hmcyp11a1，牛源(bos taurus)的btcyp11a1或野猪源(sus sus scrofa)的sscyp11a1，或其截短n端2-38氨基酸残基且活性的片段；
6、优选地，其氨基酸序列如seq id no:4-7任意之一所示；
7、进一步地，其编码基因根据酿酒酵母密码子使用偏好性进行优化。
8、另外具体地，所述cpr是：葡萄源(vitis vinifera l)的vvcpr，知母源(anemarrhenaasphodeloides)的aocpr，蓝色犁头霉(absidiacoerulea)源的aocpr或酿酒酵母自身的(saccharomyces cerevisiae)的cpr—ncp1；
9、优选地，其序列如seq id no:8-10任意之一所示。
10、优选地，所述整合是在酿酒酵母基因组的atf2位点插入。例如通过基因编辑的方法实现。
11、具体地，出发酿酒酵母是产22r-羟胆固醇的重组菌株，更具体地是基因组上整合有基因stdwf5，ggd hcr24和基因vccyp90b27；
12、更优选地，所述基因根据酿酒酵母密码子使用偏好性进行优化；具体地利用基因编辑的方法在酿酒酵母by4742的erg5位点引入基因stdwf5(优选地其核苷酸序列如seq idno：1所示)，ggdhcr24(优选地其核苷酸序列如seq id no：2所示)和基因vccyp90b27(优选地其核苷酸序列如seq id no：3所示)。
13、本发明还提供一种制备孕烯醇酮的方法，其包括培养所述的重组酿酒酵母，以使其产生孕烯醇酮的步骤。
14、任选地，还包括分离所产生的孕烯醇酮的步骤。
15、具体地，培养条件ypd培养中于28-32℃，240-260rpm，ypd培养中添加乙醇和半乳糖。分离所产生的cyp11a1的步骤是通过离心收集沉淀，随后加入玻璃珠和萃取剂，破碎超声处理和有机滤膜过滤得到cyp11a1。优选地，是加入与菌体等体积的玻璃珠和由甲醇：丙酮＝1:1(v/v)的萃取剂，破碎5min2次，超声30min，有机滤膜过滤得到孕烯醇酮。
16、本发明研究表明在酿酒酵母外源表达cyp11a1时，非天然伴侣蛋白cpr似乎比天然伴侣蛋白tadx和tadr更适合用来辅助cyp11a1产孕烯醇酮，最终达到提高产孕烯醇酮的目的，因而完成本发明。
1.一种重组酿酒酵母，其特征在于，其基因组上整合有cyp11a1的编码基因和cpr的编码基因。
2.如权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述cyp11a1是：中华大蟾蜍（bufobufogargarizans cantor）来源的bbgcyp11a1，人源（homo sapiens）的hmcyp11a1，牛源（bos taurus）的btcyp11a1或野猪源（sus sus scrofa）的sscyp11a1，或其截短n端2-38氨基酸残基且活性的片段；
3.如权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述cpr是：葡萄源（vitisvinifera l ）的vvcpr，知母源（anemarrhenaasphodeloides）的aocpr，蓝色犁头霉（absidiacoerulea）源的aocpr或酿酒酵母自身的（saccharomyces cerevisiae）的cpr—ncp1；
4.如权利要求1至3任一项所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述整合是在酿酒酵母基因组的atf2位点插入。
5.如权利要求1至3任一项所述的重组酿酒酵母，其特征在于，出发酿酒酵母是产22r-羟胆固醇的重组菌株，更具体地是基因组上整合有基因stdwf5，ggdhcr24和基因vccyp90b27；
6.一种制备孕烯醇酮的方法，其特征在于，包括培养如权利要求1至5任一项所述的重组酿酒酵母，以使其产生孕烯醇酮的步骤。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括分离所产生的孕烯醇酮的步骤。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，培养条件ypd培养中于28-32℃，240-260rpm，ypd培养中添加乙醇和半乳糖。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，分离所产生的孕烯醇酮的步骤是通过离心收集沉淀，随后加入玻璃珠和萃取剂，破碎超声处理和有机滤膜过滤得到孕烯醇酮。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，是加入与菌体等体积的玻璃珠和由甲醇：丙酮=1:1(v/v)的萃取剂，破碎5min2次，超声30min，有机滤膜过滤得到孕烯醇酮。
