本发明涉及抗体，具体而言，涉及一种抗pct抗体及其制备方法、检测试剂盒。
背景技术：
1、降钙素原（pct）是一种由116个氨基酸组成的激素前体，其分子量约为12.7kda。pct由神经内分泌细胞表达，包括甲状腺、肺和胰腺组织中的c细胞。在健康人的血清中pct浓度很低（＜0.05ng/ml），但在细菌感染后pct的水平会显著升高。大量文献表明，pct血清浓度与多种感染相关，其敏感性和特异性较强，可反映不同感染引起的炎症反应。在重要的感染性疾病如败血症中，pct具有较强的诊断价值。动物模型实验显示，在脓毒症时机体多个组织会表达pct。脓毒症患者体内的pct只有114个氨基酸，末端缺少ala-pro。因此，pct可用作脓毒症的预后指标，也是急性重症胰腺炎主要并发症的可靠指标之一。研究发现，在某些非感染性情况下，pct水平也会升高，如严重创伤后的早期阶段（例如意外创伤、外科手术、烧伤）、多器官功能不全、重症胰腺炎，以及新生儿出生后的最初几天。非感染性pct升高可能与严重的组织损伤、高浓度的促炎细胞因子在血浆中的存在、副肿瘤综合征以及严重的器官内环境紊乱相关联。
2、pct是一种免疫调节蛋白，广泛应用于炎症检测中。在生理状态下，pct主要由甲状腺滤泡旁细胞合成。当机体遭受细菌感染时，受细胞因子刺激，其他细胞（例如单核细胞、神经内分泌细胞）开始表达降钙素ⅰ基因，导致pct的持续释放。对于获得性呼吸道感染和诱导性肺炎患者，pct可作为选择抗生素和评估疗效的重要指标。在细菌感染后，pct的水平在3h内开始升高，6h-12h达到最高值，其半衰期为25h-30h。通过有效检测血清中的pct含量，可以准确评估患者的身体状况。为了提高pct检测的灵敏度，可以通过改造pct抗体的亲和力来优化试剂盒，使其能够快速且准确地反映患者的生理状态。总体而言，利用改良后的pct抗体制备高灵敏度的检测试剂盒，不仅有助于炎症的早期诊断和治疗监测，而且在市场上具有显著的应用和市场潜力。
3、然而，目前市面上很多试剂盒灵敏度不足，无法准确检测pct含量。
技术实现思路
1、本发明旨在提供一种抗pct抗体及其制备方法、检测试剂盒，通过利用引物对优选抗体的vh-cdr3区域进行改造和优化，以提升抗体的亲和力和成熟度，最终获得能够特异性识别和结合pct抗原的最佳抗体，确保了试剂盒具有高灵敏度、强特异性、良好的重复性和高准确度的优点。
2、为实现上述目的，本发明提供了一种抗pct抗体的制备方法，包括以下步骤：s1、对pct抗体的重链可变区序列的cdr3区进行随机突变、优化，构建噬菌体展示文库；s2、对pct抗体进行淘选，获得目标抗体；s3、将目标抗体与表达载体连接，表达得到单链抗体，纯化、筛选得到目标单链抗体；s4、将目标单链抗体制备全长抗体，获得抗pct抗体；其中，cdr3区的序列如seq id no.3所示。
3、本发明提供的用于制备抗pct抗体的制备方法，通过利用引物对优选抗体的vh-cdr3区域进行改造和优化，以提升抗体的亲和力和成熟度。经过筛选，获得了能够特异性识别和结合pct抗原的最佳抗体。该抗体的cdr3区序列能够制备具有高度特异性的抗体，其亲和力可达到3.5e-10，并具备独特的抗原决定簇识别位点。基于本发明筛选出的最佳抗pct抗体，制备成试剂盒并进行性能验证，结果显示，该试剂盒具有高灵敏度、强特异性、良好的重复性和高准确度的优点。此外，试剂盒成本低廉，能够有效满足当前试剂开发的需求，显示出本发明在抗体制备和试剂盒开发方面的显著优势。
4、步骤s1涉及对抗pct抗体的重链可变区（vh）中cdr3区进行随机突变和优化，cdr3区是决定抗体特异性和亲和力的关键区域，通过随机突变增加序列多样性，并通过噬菌体展示技术构建大型文库，这为筛选出高亲和力的抗体提供了基础。步骤s2中使用噬菌体展示文库对特定的pct抗体进行筛选，通过亲和力筛选使得具有高亲和力和特异性的抗体克隆被选出。步骤s3中将筛选出的抗体与表达载体连接并在宿主细胞中表达，表达后的单链抗体需纯化和进一步筛选，确保获得具有高纯度和生物活性的单链抗体。步骤s4中将纯化后的单链抗体进一步构建成全长抗体，全长抗体具备更完整的免疫功能和更高的稳定性。
5、上述任一技术方案中，在s1中，对pct抗体的重链可变区序列的cdr3区进行随机突变、优化之前，还包括：通过可变区引物对pct抗体进行扩增和测序，得到轻链可变区序列和重链可变区序列；其中，轻链可变区序列如seq id no.1所示，重链可变区序列如seq idno.2所示。
6、在对cdr3区进行随机突变和优化之前，本实施例中包含了对pct抗体轻链和重链可变区序列进行扩增和测序的步骤，该步骤利用特定的可变区引物对这些序列进行pcr扩增，随后进行测序以确定其精确的核苷酸组成。通过这种方法，可以获得详细的序列信息，有利于后续的突变和优化工作。
7、上述任一技术方案中，在s1中，对pct抗体的重链可变区序列的cdr3区进行随机突变、优化，具体包括：使用trimer引物对cdr3区进行pcr扩增，得到的pcr扩增产物为突变后的dna文库；其中，扩增所用引物分别如seq id no.4，seq id no.5，seq id no.6所示。
8、在对pct抗体的重链可变区序列的cdr3区进行突变和优化的过程中，采用了trimer引物进行pcr扩增。trimer引物是一种特殊设计的引物，它包含了预先设计的突变，能够在pcr过程中引入这些突变到目标dna序列中。利用这些特殊的trimer引物，对cdr3区进行扩增，结果产生了含有预期突变的dna文库。该步骤是整个抗体工程过程中关键的一环，因为它直接决定了产生的抗体变体的多样性和质量。
9、上述任一技术方案中，在s1中，还包括：将pcr扩增产物与展示载体连接，构建得到噬菌体展示文库。
10、在pcr扩增得到特定突变的dna文库后，这些dna片段将与一个噬菌体展示载体连接。展示载体是经过工程化的噬菌体，可以表达连接在其表面蛋白上的外源蛋白或肽段，通过将pcr产物插入到这种载体中，可以实现特定蛋白或抗体片段的表面展示。连接后，利用这些载体构建出一个噬菌体展示文库，该文库包含了多种不同的蛋白变体，每种变体都能在噬菌体表面展示，便于后续的筛选和功能评估。
11、上述任一技术方案中，改造后的pct抗体中的cdr3区，其序列如seq id no.7所示。
12、在抗体工程中，互补决定区（cdr）是抗体分子中与抗原结合的关键部分，cdr3区对抗体的亲和力和特异性有显著影响。本技术中提到的改造后的pct抗体的cdr3区域通过基因工程手段进行了特定的序列修改，序列号为seq id no.7，这种改造是基于原有序列的优化或重新设计，以提高抗体的结合特性或稳定性。
13、上述任一技术方案中，在s2中，对pct抗体进行淘选，具体包括：在pbs重悬后的二代抗体噬菌体中加入2%-5%的酪蛋白，封闭1h；同时封闭空的离心管及磁珠1h；抗体噬菌体封闭1h后加入生物素标记的pct抗原，混合1h后，加入封闭好的磁珠，反应半小时；洗去未结合的抗体噬菌体，更换封闭好的离心管，去除上清；将磁珠感染tg1进入下一轮筛选，筛选3-5轮，每轮筛选后随机挑选单克隆进行elisa检测，挑选阳性单克隆测序，分析序列富集程度，选取序列进行表达。
14、淘选过程：该技术涉及一种使用噬菌体展示库对pct抗体进行筛选的方法，首先将二代抗体噬菌体在含2%-5%酪蛋白的pbs中重新悬浮并封闭，以减少非特异性结合，同时，对空的离心管和磁珠也进行封闭，以优化接下来的筛选效率。抗体噬菌体与pct抗原的结合：封闭后，向噬菌体中加入生物素标记的pct抗原进行混合和结合，再通过封闭的磁珠来捕获抗体噬菌体与抗原复合物。筛选和elisa检测：经过反应和洗涤步骤后，磁珠将用于感染tg1细菌，进入后续多轮的筛选，每轮筛选后，通过elisa检测随机挑选的单克隆，以确定其对pct抗原的结合能力。序列分析和表达：选出阳性单克隆后，进行序列分析以评估序列的富集程度，并选择具有代表性的序列进行进一步的表达研究。
15、上述任一技术方案中，在s3中，还包括：将表达、纯化得到的单链抗体进行活性检测和亲和力检测，将检测结果按优到次排序，选取检测结果为优的单链抗体作为目标单链抗体。
16、表达和纯化后的单链抗体首先在适当的宿主系统中表达，随后通过多种生化方法进行纯化，确保获得高纯度的蛋白供后续测试使用。完成纯化后，单链抗体将进行一系列的生物化学和生物物理检测，包括活性检测和亲和力检测。活性检测是为了评估抗体是否能有效地识别和结合其特定的抗原；而亲和力检测则用于评估抗体与抗原结合的强度和稳定性。基于检测结果，这些单链抗体将按照其性能从优到次进行排序。最终，选择性能最优的单链抗体作为目标单链抗体，以供进一步的开发和应用。
17、上述任一技术方案中，表达载体为pet-22b载体。
18、pet-22b适用于在大肠杆菌等原核表达系统中表达重组蛋白，此载体具有强大的t7启动子，可以在有t7聚合酶存在的情况下高效地启动蛋白的表达。此外，pet-22b载体还包括一个抗生素抗性基因，用于选择性地筛选含有载体的细胞，以及一个密码子优化过的标签，用于简化后续的蛋白纯化和检测过程。
19、本发明还提供了一种抗pct抗体，采用如上所述的制备方法制备得到。
20、抗pct抗体的制备方法涉及使用前述的pet-22b表达载体，通过将编码抗pct抗体的基因克隆到pet-22b载体中，并在适当的宿主细胞中表达，可以高效产生抗体。通过使用定制的抗体生产方法，可以获得高度特异性的抗体，这对于临床和实验室中pct水平的精确测定非常重要。使用pet-22b载体可以实现高效的抗体表达，并通过其内置的纯化标签简化后续的纯化过程，从而降低生产成本并缩短生产周期。
21、本发明还提供了一种pct检测试剂盒，包括如上所述的抗pct抗体。
22、本发明中提供的pct检测试剂盒是一种用于检测血液或其他生物样本中pct水平的工具，该试剂盒包括前述所制备的抗pct抗体，这些抗体能够特异性地识别并结合pct，从而实现其在样本中的检测。试剂盒包括基本的实验材料和工具，如预涂有抗pct抗体的微孔板、用于洗涤的缓冲液、用于发色反应的底物液、标准品以及操作说明书，这些元素共同工作，以提供快速、准确的pct测定。
1.一种抗pct抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述s1中，所述对pct抗体的重链可变区序列的cdr3区进行随机突变、优化之前，还包括：
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述s1中，所述对pct抗体的重链可变区序列的cdr3区进行随机突变、优化，具体包括：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在所述s1中，还包括：
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，改造后的所述pct抗体中的cdr3区，其序列如seq id no.7所示。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述s2中，所述对所述pct抗体进行淘选，具体包括：
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述s3中，还包括：
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为pet-22b载体。
9.一种抗pct抗体，其特征在于，采用如权利要求1-8中任一项所述的制备方法制备得到。
10.一种pct检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求9所述的抗pct抗体。
