本发明涉及一种产l-天冬酰胺酶的黑曲霉重组菌株及应用，属于基因工程。
背景技术：
1、天冬酰胺酶(ec.3.5.1.1，l-asnase)属于酰胺水解酶，可催化l-天冬酰胺水解生成l-天冬氨酸和氨，从而减少食品高温加工中致癌物丙烯酰胺(acrylamide，am)的生成。
2、黑曲霉(aspergillus niger)作为食品安全表达宿主，是食品级l-asnase生产国标菌株，但天然菌株发酵水平低，难以实现较高的天冬酰胺酶产量。目前市场上商业化的l-asnase均来源于嗜温微生物，在高温时的热稳定性较差，不适用于80℃以上的食品加工环境。因此，需要开发提高适用于高温环境的天冬酰胺酶表达量的策略。
技术实现思路
1、本发明利用整合位点优化和n端融合策略进提高l-asnase在黑曲霉中的表达量，从而获得高产l-asnase的黑曲霉重组菌株，并通过发酵培养基成分优化策略进一步提高其表达量。
2、本发明提供了一种重组黑曲霉，在出发菌株的基础上整合表达seq id no.2所示的l-天冬酰胺酶基因。
3、在一种实施方式中，所述重组黑曲霉还含有如下至少一种改进：
4、(1)在l-天冬酰胺酶的n端融合50～150个氨基酸的glaa序列；
5、(2)将所述l-天冬酰胺酶的编码基因整合在amya位点或amma位点。
6、在一种实施方式中，所述glaa序列的编码基因如seq id no.6～8任一所示。
7、在一种实施方式中，所述amya的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述amma的核苷酸序列如seq id no.5所示。
8、在一种实施方式中，所述出发菌株为黑曲霉cctcc m 2018881或黑曲霉△kusa；所述黑曲霉cctcc m 2018881已公开于公开号为cn110438018a的专利申请文件中；所述黑曲霉△kusa是在黑曲霉cctcc m 2018881的基础上敲除了kusa和pyrg基因，该菌株已公开于论文《木聚糖酶的分子改造及在黑曲霉中的高效表达》中。
9、本发明还提供了提高重组黑曲霉l-天冬酰胺酶产量的方法，包括(a)～(c)任一种：
10、(a)在l-天冬酰胺酶的n端融合50～150个氨基酸的glaa序列；所述l-天冬酰胺酶的氨基酸序列如seq id no.3所示；
11、(b)将l-天冬酰胺酶的编码基因整合在amya位点或amma位点；所述l-天冬酰胺酶的编码基因如seq id no.3所示；
12、(c)将重组黑曲霉在含mn 2+的发酵培养基中发酵；
13、(d)将重组黑曲霉在含槐糖的发酵培养基中发酵；所述槐糖在培养基中的浓度为0.05mm。
14、在一种实施方式中，所述mn 2+在培养基中的浓度为0.025～0.05g/l。
15、在一种实施方式中，所述重组黑曲霉以黑曲霉cctcc m 2018881或黑曲霉△kusa为出发菌株。
16、本发明还提供了制备l-天冬酰胺酶的方法，是将重组黑曲霉在培养基中发酵产酶。
17、在一种实施方式中，所述培养基含有l-天冬酰胺、玉米浆、玉米淀粉、麦芽提取物、精制黄豆饼粉、mn 2+和槐糖。
18、在一种实施方式中，所述方法是将重组黑曲霉在种子培养基中，于28～30℃培养24～36h，获得种子液，再将种子液转移至发酵培养基中发酵至少36h。
19、在一种实施方式中，所述方法是将黑曲霉重组菌株在pda培养基中培养7d，利用无菌水制备孢子悬液并接种至黑曲霉种子培养基中，以30℃，220r·min-1培养36h；取3ml种子液转接至黑曲霉发酵培养基中以30℃，220r/min培养144h。
20、本发明还提供了所述重组黑曲霉或所述方法在生产l-天冬酰胺酶或含l-天冬酰胺酶的酶制剂中的应用。
21、有益效果：
22、(1)本发明表达了thermococcus zilligii来源的l-天冬酰胺酶(tzi)，通过随机整合至黑曲霉ag11基因组从而获得重组菌株ans-tzi，酶活可达91.25u·ml-1。
23、(2)由于随机整合方式主要依赖于非同源末端连接(nhej)机制，这导致转化子在不同基因座上的表达水平差异显著，并且基因拷贝数也难以确定。为了提高异源蛋白的产量，本发明采用crispr技术，通过同源重组将外源基因精确地整合到a.niger基因组的高表达位点amma位点上，构建的重组菌ank-amma酶活提升了14％。
24、(3)本发明将糖化酶(glaa)的前50、100、500个氨基酸与l-天冬酰胺酶的n端进行融合，并定点整合至amma位点，与ank-amma相比，除融合50个氨基酸后tzi酶活略有下降外，融合100个和500个氨基酸酶活分别提升9.9％和307.2％，其中g3-amma的酶活可达423.89u·ml-1，与ans-tzi产酶能力相比提升3.64倍。
25、(4)本发明还对黑曲霉重组菌的发酵培养基进行了优化，通过向发酵培养基中加入0.025g/l mn2+与0.05mm槐糖，可使菌株g3-amma生产的l0天冬酰胺酶酶活进一步提升至486.74u/ml。
1.一种重组黑曲霉，其特征在于，在出发菌株的基础上整合表达如seq id no.2所示的l-天冬酰胺酶基因。
2.根据权利要求1所述的重组黑曲霉，其特征在于，所述重组黑曲霉还含有如下至少一种改进：
3.根据权利要求2所述的重组黑曲霉，其特征在于，所述glaa序列的编码基因如seq idno.6～8任一所示。
4.根据权利要求2所述的重组黑曲霉，其特征在于，所述amya的核苷酸序列如seq idno.4所示；所述amma的核苷酸序列如seq id no.5所示。
5.根据权利要求1～4任一所述的重组黑曲霉，其特征在于，所述出发菌株为黑曲霉cctcc m 2018881或黑曲霉△kusa。
6.一种提高重组黑曲霉l-天冬酰胺酶产量的方法，其特征在于，包括(a)～(c)任一种：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述重组黑曲霉以黑曲霉cctcc m2018881或黑曲霉△kusa为出发菌株。
8.一种制备l-天冬酰胺酶的方法，其特征在于，将重组黑曲霉在培养基中发酵产酶；所述培养基含有l-天冬酰胺、玉米浆、玉米淀粉、麦芽提取物、精制黄豆饼粉、mn 2+和槐糖。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法是将重组黑曲霉在种子培养基中，于28～30℃培养24～36h，获得种子液，再将种子液转移至发酵培养基中发酵至少36h。
10.权利要求1～5任一所述的重组黑曲霉，或权利要求6～9任一所述方法在生产l-天冬酰胺酶或含l-天冬酰胺酶的酶制剂中的应用。
