本发明涉及肉类新鲜度及致病菌检测。更具体的说，本发明涉及基于bi4nbo8cl/pani纳米复合材料的光电化学-电化学双模传感器和气敏传感器及其制备方法。
背景技术：
1、猪肉变质过程会伴随食源性致病菌和挥发性盐基氮(tvb-n)的产生，肠炎沙门氏菌是食源性致病菌的一种，感染会引起患者发烧，呕吐和腹泻，严重情况下甚至会危及生命。tvb-n是肉类食品在腐败过程中，由于蛋白质分解产生的碱性含氮物质，能够反应肉品的腐败情况，已有文献表明能够以氨气作为tvb-n的代表性物质对猪肉新鲜度进行判别。在该过程中，建立快速灵敏的致病菌和tvb-n检测器件和方法对于食品安全具有重要意义，但目前用于致病菌检测的生物传感器多数依赖单信号输出，难以避免受到各种外界因素的干扰，且大多数电极材料不具备气敏性能，这使得无法利用同种材料去同时构建生物传感器和气敏传感器。
2、在该基础上，开发出能够达到光电-电化学双模式检测，以及开发出一种具有气敏性能的材料去同时构建光电化学-电化学双模传感器和气敏传感器，对于致病菌定性定量检测和利用氨气浓度判别肉类新鲜度具有研究意义。
技术实现思路
1、为了实现根据本发明的这些目的和其他优点，本发明提供了一种基于bi4nbo8cl/pani纳米复合材料的传感器及其制备方法，并以此为基础进行肉类新鲜度及致病菌检测的方法。
2、一种基于bi4nbo8cl/pani纳米复合材料的肉类传感检测系统，所述传感检测系统包括光电化学-电化学双模传感单元和气敏传感单元，所述光电化学-电化学双模传感单元包括电解槽、工作电极、饱和甘汞电极、铂对电极、电化学工作站和光源系统；
3、所述气敏传感单元包括气敏元件，气敏原件测试仪和分析模块；
4、所述光电化学-电化学双模传感单元用以检测肉类样品中的光电流和dpv数值；
5、所述气敏传感单元用以检测肉类样品的氨气释放量；
6、所述工作电极为au/bi4nbo8cl/pani/fto电极，并通过se适配体、适配体的cdna和发夹dna(h1,h2)进行杂交链式反应，利用杂交链式反应作为生物传感信号放大策略；其中au/bi4nbo8cl/pani/fto为工作电极的基底层，se适配体位于基底层表面，并作为连接基底与杂交链式反应的中间层；通过se适配体、适配体的cdna和发夹dna(h1,h2)进行杂交链式反应，在工作电极表面构建超长dna双链层，超长dna双链层为亚甲基蓝(mb)提供结合位点；
7、所述气敏元件表面包覆有bi4nbo8cl/pani复合材料。
8、进一步的，工作电极中，采用亚甲基蓝(mb)在电极表面孵育，使其嵌入进超长dna双链层的dna双螺旋结构中。
9、进一步的，se适配体通过au-s键被固定在基底表面；
10、基底表面未连接上适配体的纳米金活性位点通过与6-羟基-1-己硫醇结合进行封闭；
11、所述杂交链式反应中，cdna作为开启杂交链式反应(hcr)的启动子。
12、进一步的，先通过三(2-羧乙基)膦对se适配体进行活化，并使标记在寡核苷酸连上的巯基处于活跃状态；
13、杂交链式反应中，通过发夹dna h1和h2混合液在电极表面孵育，使杂交链式反应在电极表面进行。
14、进一步的，利用所述传感检测系统进行肉类检测的方法，首先利用se病菌原液，以及猪肉样品进行前处理，得到人工模拟se污染溶液，即含不同浓度se的致病菌溶液；
15、肉类检测的方法包括如下步骤：
16、步骤1、在工作电极上滴加30μl含不同浓度se的致病菌溶液孵育60min，用去离子水缓慢冲洗电极；
17、步骤2、将特定浓度的氨气注入配气箱中，按动加热键快速蒸发，记录当前电阻；最后打开配气箱，并对其电阻进行测量，再次记录电阻；
18、步骤3、监测基于bi4nbo8cl/pani纳米复合材料的光电化学-电化学双模传感器的光电流和dpv变化；监测基于bi4nbo8cl/pani纳米复合材料的气敏传感器的气敏响应变化；
19、步骤4、当光电流和dpv的数值降低时，证明肉类中含有se，证明样品肉为不合格肉，以此完成定性检测；
20、步骤5、将光电流或dpv数值分别带入se定量评价模型ⅰ和ⅱ，计算得到se的浓度值，以此完成对致病菌的定量检测；
21、步骤6、根据基于bi4nbo8cl/pani纳米复合材料的气敏传感器的气敏响应变化情况，获得电阻信号和氨气浓度之间的关系，根据氨气浓度判定猪肉的新鲜度。
22、具体为通过氨气浓度确定挥发性盐基氮含量，将挥发性盐基氮含量<15mg/100g的猪肉确定为新鲜猪肉，挥发性盐基氮含量<20mg/100g猪肉确定为次新鲜肉,挥发性盐基氮含量>20mg/100g猪肉确定为腐败猪肉。
23、进一步的，步骤5中的se定量评价模型ⅰ为：y＝-23.2x+472
24、其中y表示孵育se后的光电流强度，x为致病菌浓度的对数(logcse)；
25、se定量评价模型ⅱ为：y＝-31.8x+453
26、其中y表示孵育se后的dpv强度，x为致病菌浓度的对数(logcse)。
27、进一步的，所述系统的制备方法，包括如下步骤：
28、步骤1、制备bi4nbo8cl/pani纳米复合电极
29、采用biocl、nb2o5、bi2o3、nacl和kcl，球磨后煅烧得到bi4nbo8cl粉末，与苯胺单体混合，再加入过硫酸铵，搅拌后得到bi4nbo8cl/pani，其中pani为聚苯胺；
30、步骤2、au/bi4nbo8cl/pani/fto电极的制备
31、将金纳米粒子滴涂于bi4nbo8cl/pani/fto电极表面得到au/bi4nbo8cl/pani/fto电极；
32、步骤3、构建基于bi4nbo8cl/pani纳米复合材料的光电化学-电化学双模传感器工作电极
33、将肠炎沙门氏菌适配体用三(2-羧乙基)膦活化后滴涂在au/bi4nbo8cl/pani/fto电极上；随后用6-羟基-1-己硫醇封闭；将se适配体的互补dna滴在电极上，并使apt与cdna杂交；取等量的发夹dna h1和h2混合，再取混合液滴于电极表面孵育，使杂交链式反应在电极表面进行；再将mb滴于电极表面孵育，后即得到工作电极；
34、优选的，cdna，h1，h2浓度为2-5μm，mb浓度为0.02-0.05g/ml。
35、优选的，滴涂完h1 h2混合液后孵育时间为30-90min，滴涂完mb后孵育时间为30-60min。
36、步骤4、构建基于bi4nbo8cl/pani纳米复合材料的光电化学-电化学双模传感器
37、将步骤3制备的工作电极插入电解槽中，再将饱和甘汞电极和铂对电极插入，组成三电极体系，外接电化学工作站，辅以氙灯光源系统模拟太阳光，即组装成了基于bi4nbo8cl/pani复合材料的光电-电化学双模传感器，用于se的光电化学和电化学双模式检测；
38、优选的，检测时滴完se后孵育时间为30-60min左右。
39、步骤5、构建基于bi4nbo8cl/pani纳米复合材料的气敏传感器
40、步骤1中所制备的bi4nbo8cl/pani复合材料置于研钵内，加入无水乙醇溶液得到糊状品，并滴在气敏原件上，静置干燥完毕后放入ws-30a型气敏原件测试仪，连接电脑，即组装成了基于bi4nbo8cl/pani复合材料的气敏传感器。
41、优选的，气敏检测在160℃条件下测试。
42、进一步的，所述系统的制备方法中，步骤1的制备bi4nbo8cl/pani/fto电极具体为：
43、将掺杂氟的sno2导电玻璃(fto)先后用丙酮、无水乙醇、去离子水清洗，烘干备用。将biocl(1.3g)、nb2o5(0.66g)、bi2o3(3.49g)、nacl(2.92g)和kcl(3.7g)放入球磨机，研磨30min。将混合均匀的粉末在700℃下煅烧3h。收集烧结完成的粉末，用90℃的去离子水多次洗涤后，收集并干燥，得到黄色的bi4nbo8cl粉末。将制备的bi4nbo8cl粉末按照质量比1:4与苯胺单体混合，再缓慢加入过硫酸铵，磁力搅拌6h，最终洗涤干燥得到bi4nbo8cl/pani。再取0.01g bi4nbo8cl/pani复合材料与1ml乙二醇置于玛瑙研钵中研磨5min，得到均匀的bi4nbo8cl/pani浆料，取30μl bi4nbo8cl/pani浆料滴于fto表面，放入60℃烘箱中干燥6h，得到bi4nbo8cl/pani/fto电极。
44、进一步的，所述系统的制备方法中，步骤2的au/bi4nbo8cl/pani/fto电极的制备具体为：
45、取30μl实验室所制备的金纳米粒子滴涂于bi4nbo8cl/pani/fto电极表面，室温干燥后得到au/bi4nbo8cl/pani/fto电极，将电极置与4℃冰箱保存备用。
46、进一步的，所述系统的制备方法中，步骤3的构建基于bi4nbo8cl/pani纳米复合材料的光电化学-电化学双模传感器工作电极具体为：
47、首先将2μm se适配体用三(2-羧乙基)膦(tcep)(0.6μl，10mm)活化1h，使标记在寡核苷酸连上的巯基处于活跃状态，以备后续使用。au/bi4nbo8cl/pani/fto为工作电极的基底层，取30μl活化完毕的se适配体滴涂在au/bi4nbo8cl/pani/fto表面，在4℃下孵化过夜，巯基标记的适配体将通过au-s键被固定在电极表面，适配体层将作为连接基底与杂交链式反应的“桥梁”。然后将30μl 6-羟基-1-己硫醇(mch)滴于电极表面孵育1h，mch将与电极表面未连接上适配体的纳米金结合，对未结合的活性位点进行封闭。去离子水冲洗后，将30μl2μm se适配体的互补dna(cdna)滴在电极上，并在4℃下孵育1h使apt与cdna杂交，cdna将作为开启杂交链式反应(hcr)的启动子而存在。取等量的浓度为2μm的发夹dna h1和h2混合，再取60μl混合液滴于电极表面孵育，使hcr在电极表面进行，反应后，电极表面将存在大量的超长dna双链，此超长双链层能够为亚甲基蓝(mb)提供大量的结合位点。再将30μl mb(0.03g/ml)滴于电极表面孵育，使mb充分的嵌入进dna双螺旋结构之中，最后用去离子水缓慢冲洗，除去未结合的mb，即得到工作电极。
48、进一步的，所述系统的制备方法中，步骤4的构建基于bi4nbo8cl/pani纳米复合材料的光电化学-电化学双模传感器具体为：
49、将步骤3制备的工作电极插入电解槽中，再将饱和甘汞电极和铂对电极插入，组成三电极体系，外接电化学工作站，辅以氙灯光源系统模拟太阳光，即组装成了基于bi4nbo8cl/pani复合材料的光电-电化学双模传感器，用于se的光电化学和电化学双模式检测。
50、优选的，光电化学与电化学检测均是在室温下用含有0.1m抗坏血酸(aa)的磷酸盐缓冲溶液(pbs，ph＝7.4，0.1m)中进行。测试过程中光电化学检测由模拟日光氙灯系统提供光源，光源每20s开关一次，外加电压为0.0v，以i-t记录光电化学信号。电化学检测时关闭光源，以dpv记录电化学信号。
51、进一步的，所述系统的制备方法中，步骤5的构建基于bi4nbo8cl/pani纳米复合材料的气敏传感器具体为：
52、取少量步骤1中所制备的bi4nbo8cl/pani复合材料置于研钵内，加入少量无水乙醇溶液，用研棒反复碾压成糊状，然后用胶头滴管将糊状样品均匀地滴在气敏原件上，静置干燥完毕后放入ws-30a型气敏原件测试仪，连接电脑，即组装成了基于bi4nbo8cl/pani复合材料的气敏传感器。
53、本发明所构建的基于bi4nbo8cl/pani复合材料的肉类新鲜度检测传感器用于肠炎沙门氏菌的定性定量检测和氨气的快速检测，也适用于其它食源性致病菌定性定量检测和tvb-n的快速检测。协同光电化学，电化学和气敏传感对猪肉新鲜度进行判别。
54、本发明所构建的基于bi4nbo8cl/pani复合材料的肉类新鲜度检测传感器是利用具有气敏功能的材料同时构建生物传感器和气敏传感器。生物传感器能够利用适配体的特异性实现定性和定量检测，气敏传感器能够依据氨气浓度对肉类新鲜度进行判定。其优点以及特色如下：
55、(1)所制备的bi4nbo8cl/pani复合材料既具有可见光响应能力，又具有能够响应氨气的气敏能力。能够实现利用该复合材料同时构建生物传感器和气敏传感器。
56、(2)利用mb作为信号探针，不仅能为系统提供额外的电化学信号实现双模检测，还能够利用其自身的光电化学活性和电化学活性实现系统的信号放大。
57、(3)利用杂交链式反应作为生物传感信号放大策略，在电极表面生成的长dna双链结构能够为mb提供大量嵌入位点，实现更进一步的光电流和电流的双重信号放大。设计合理的检测策略，未孵化se时，电极表面有大量的mb，由于敏化作用，光电流和电流信号都处于增强状态。而当传感器孵化se后，apt与se结合，导致电极表面双链结构远离电极，进而导致敏化剂mb远离电极，敏化作用大大降低，光电流和电流强度也显著降低。
58、(4)协同了光电化学，电化学和气敏传感对猪肉新鲜度进行判别。光电化学和电化学传感能够依靠适配的特异性对致病菌进行定性，并通过所得检测浓度判断致病感染程度。气敏传感能够依靠氨气浓度对猪肉新鲜度进行判别。
59、(5)se检测时间短，成本低廉，操作简单。复合材料对氨气的响应灵敏，具有构建能够检测氨气浓度的气敏传感器的潜在可能性。
1.一种基于bi4nbo8cl/pani纳米复合材料的肉类传感检测系统，其特征在于，
2.根据权利要求1所述的一种基于bi4nbo8cl/pani纳米复合材料的肉类传感检测系统，其特征在于，工作电极中，采用亚甲基蓝(mb)在电极表面孵育，使其嵌入进超长dna双链层的dna双螺旋结构中。
3.根据权利要求2所述的一种基于bi4nbo8cl/pani纳米复合材料的肉类传感检测系统，其特征在于，
4.根据权利要求3所述的一种基于bi4nbo8cl/pani纳米复合材料的肉类传感检测系统，其特征在于，
5.利用权利要求1-4任一项所述传感检测系统进行肉类检测的方法，其特征在于，首先利用se病菌原液，以及猪肉样品进行前处理，得到人工模拟se污染溶液，即含不同浓度se的致病菌溶液；肉类检测的方法包括如下步骤：
6.利用权利要求5所述传感检测系统进行肉类检测的方法，其特征在于，步骤5中的se定量评价模型ⅰ为：y＝-23.2x+472
7.权利要求1-4任一项所述系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
