本发明属于生物工程，涉及产灵芝酸dm的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术：
1、灵芝是一种珍贵的药用真菌，已在传统中药中用作草药超过2000年。灵芝在治疗和预防各种疾病中都有显著作用，如抗肿瘤、抗肝纤维化、缓解高血糖、降脂和抗动脉粥样硬化等。此外，灵芝还在营养保健品和化妆品行业有广泛应用。随着生物技术的发展，许多研究者对灵芝的生物活性成分和灵芝衍生产品进行了深入的研究，发现其中起主要作用的物质为萜类、多糖类、甾醇类等。
2、灵芝酸，属于三萜类化合物，是灵芝中的一种主要活性成分。研究表明，灵芝酸在如抗肿瘤、抗衰老、抗炎症、抗抑郁、抗癫痫、治疗阿尔茨海默病等方面有重要作用。灵芝酸种类多样，结构复杂，多种灵芝酸在药物研制过程中已进入临床前或临床研究。灵芝酸a及其酰胺类衍生物通过调控p53-mdm2通路，抑制多种类型的肿瘤细胞。灵芝酸a还通过诱导t细胞的细胞毒性增强奥沙利铂的肿瘤抑制功能。灵芝酸dm(ganoderic acid dm,ga-dm)可通过抑制akt/mtor活性诱导非小细胞肺癌细胞发生自噬凋亡；此外，ga-dm在诱导癌细胞死亡的同时对其他正常细胞表现出最小的毒性。已发表的研究表明，在癌症治疗中利用ga-dm作为对抗晚期癌症的替代或补充治疗有广阔的前景。
3、获得灵芝酸的主要方式是从灵芝子实体和孢子中提取灵芝酸，但野生灵芝资源稀少、价格昂贵，人工种植的灵芝，产品质量不均一的同时生产力低下。近年来，研究者采用灵芝菌丝体深层发酵的技术提取灵芝酸，虽然具有省时、省力、节能和环保等优点，然而灵芝菌发酵中灵芝酸含量低的现状无法实现规模化生产灵芝酸单体，限制了包括ga-dm在内的灵芝酸的临床应用。因此，解析灵芝酸生物合成途径对于提高灵芝酸含量具有重要意义。同时，运用合成生物学方法改造工业微生物合成灵芝酸可解决上述问题。
4、研究表明，灵芝酸的生物合成是以乙酰辅酶a为前体物质再经过甲羟戊酸途径(mevalonate pathway,mva)进行合成。首先3分子的乙酰辅酶a经过2次缩合形成3-羟基-3-甲基-戊二酸单酰辅酶a，随后在3-羟基-3-甲基-戊二酸单酰辅酶a还原酶的作用下生成甲羟戊酸。再经过甲基戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶和焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶连续作用下生成异戊烯基焦磷酸酯(isopenteyl-pyrophsphate，ipp)。ipp在异戊二烯焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase，idi)激活下可异构化生成二甲丙烯焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，dmapp)。2分子ipp和1分子dmapp在法尼基磷酸合酶催化下头尾缩合成法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate，fpp)。fpp在鲨烯合成酶催化下转化为鲨烯，随后在羊毛甾醇(lanosterol)合成酶催化下生成羊毛甾醇。然而，羊毛甾醇经过哪些反应最终合成灵芝酸的途径尚不清楚；实际上，现有技术还未解析出灵芝酸生物合成所需的大多数酶，仅鉴定出少量灵芝酸合成酶。目前，灵芝酸含量低且种类多可能导致灵芝酸生物合成关键酶的鉴定进展缓慢，因此绝大多数灵芝酸的异源生物合成尚无法实现。
技术实现思路
1、本发明的目的之一在于针对上述现有技术的不足，提供一种产灵芝酸dm的基因工程菌，该基因工程菌能够实现灵芝酸的异源合成，且能够高效合成灵芝酸dm。
2、本发明的目的之二在于提供一种产灵芝酸dm的基因工程菌的构建方法，该方法能够突破目前对灵芝酸生物合成酶认知的局限性，实现灵芝酸的异源合成。
3、本发明的目的之三在于提供一种产灵芝酸dm的基因工程菌的应用，以实现异源高效生产灵芝酸dm。
4、为此，本发明第一方面提供了一种产灵芝酸dm的基因工程菌，其为表达外源性编码cyp450酶的cyp5150l8基因、编码7α-羟化酶的cyp7a1基因、编码3β-羟基类固醇脱氢酶的hsd3b7基因以及编码7α-羟基类固醇脱氢酶的7α-hsdh基因的重组酵母细胞。
5、在本发明的一些实施例中，所述cyp5150l8基因包括来源于灵芝(ganodermalucidum)且经过密码子优化的编码cyp450酶的cyp5150l8基因；优选地，所述cyp5150l8基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
6、在本发明的一些实施例中，所述cyp7a1基因包括来源于智人且经过密码子优化的编码7α-羟化酶的cyp7a1基因；优选地，所述cyp7a1基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
7、在本发明的一些实施例中，所述hsd3b7基因包括来源于智人(homo sapiens)且经过密码子优化的编码3β-羟基类固醇脱氢酶的hsd3b7基因；优选地，所述hsd3b7基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
8、在本发明的一些实施例中，所述7α-hsdh基因包括来源于沙丁梭菌(clostridiumsardiniense)且经过密码子优化的编码7α-羟基类固醇脱氢酶的7α-hsdh基因；优选地，所述7α-hsdh基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
9、本发明中，所述表达的方式为质粒表达或基因组整合表达。
10、根据本发明，所述基因工程菌为经过了底盘改造的基因工程菌；所述底盘改造包括前体合成途径的优化。
11、优选地，所述前体合成途径的优化包括在重组酵母细胞中过表达内源性编码羟甲基戊二酰辅酶a还原酶的thmg1基因、编码异戊烯基二磷酸δ-异构酶的idi1基因、编码法尼基焦磷酸合成酶的erg20基因、编码甲羟戊酸激酶的erg12基因和内源性转录激活因子upc2基因中的一种或几种。
12、在本发明的一些具体的实施例中，所述前体合成途径的优化为在重组酵母细胞中过表达编码羟甲基戊二酰辅酶a还原酶的thmg1基因。
13、在本发明的一些具体的实施例中，所述前体合成途径的优化为在重组酵母细胞中过表达编码羟甲基戊二酰辅酶a还原酶的thmg1基因和编码异戊烯基二磷酸δ-异构酶的idi1基因。
14、在本发明的一些具体的实施例中，所述前体合成途径的优化为在重组酵母细胞中过表达编码羟甲基戊二酰辅酶a还原酶的thmg1基因、编码异戊烯基二磷酸δ-异构酶的idi1基因和编码法尼基焦磷酸合成酶的erg20基因。
15、在本发明的一些具体的实施例中，所述前体合成途径的优化为在重组酵母细胞中过表达编码羟甲基戊二酰辅酶a还原酶的thmg1基因、编码异戊烯基二磷酸δ-异构酶的idi1基因、编码法尼基焦磷酸合成酶的erg20基因和编码甲羟戊酸激酶的erg12基因。
16、在本发明的一些具体的实施例中，所述前体合成途径的优化为在重组酵母细胞中过表达编码羟甲基戊二酰辅酶a还原酶的thmg1基因、编码异戊烯基二磷酸δ-异构酶的idi1基因、编码法尼基焦磷酸合成酶的erg20基因、编码甲羟戊酸激酶的erg12基因和转录激活因子upc2基因。
17、本发明中，所述酵母细胞选自由以下酵母细胞构成的组：解脂耶氏酵母、红冬孢酵母、油脂酵母、产油油脂酵母、胶粘红酵母、弯曲隐球酵母、弯曲假丝酵母、发酵丝孢酵母、拉考夫假丝酵母、铁红假丝酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母、皮状丝孢酵母和酿酒酵母，优选为酿酒酵母。
18、本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述的基因工程菌的构建方法，其包括：构建重组酵母细胞a的步骤：以酵母细胞为底盘株表达外源性编码cyp450酶的cyp5150l8基因、编码7α-羟化酶的cyp7a1基因、编码3β-羟基类固醇脱氢酶的hsd3b7基因以及编码7α-羟基类固醇脱氢酶的7α-hsdh基因获得重组酵母细胞a。
19、根据本发明，所述构建方法还包括在构建重组酵母细胞a的步骤之后优化前体合成途径的步骤，其包括：
20、在重组酵母细胞a中过表达编码羟甲基戊二酰辅酶a还原酶的thmg1基因，获得重组酵母细胞b；
21、或者，在重组酵母细胞中过表达编码羟甲基戊二酰辅酶a还原酶的thmg1基因和编码异戊烯基二磷酸δ-异构酶的idi1基因，获得重组酵母细胞c；
22、或者，在重组酵母细胞中过表达编码羟甲基戊二酰辅酶a还原酶的thmg1基因、编码异戊烯基二磷酸δ-异构酶的idi1基因和编码法尼基焦磷酸合成酶的erg20基因，获得重组酵母细胞d；
23、或者，在重组酵母细胞中过表达编码羟甲基戊二酰辅酶a还原酶的thmg1基因、编码异戊烯基二磷酸δ-异构酶的idi1基因、编码法尼基焦磷酸合成酶的erg20基因和编码甲羟戊酸激酶的erg12基因，获得重组酵母细胞e；
24、或者，在重组酵母细胞中过表达编码羟甲基戊二酰辅酶a还原酶的thmg1基因、编码异戊烯基二磷酸δ-异构酶的idi1基因、编码法尼基焦磷酸合成酶的erg20基因、编码甲羟戊酸激酶的erg12基因和内源性转录激活因子upc2基因，获得重组酵母细胞f。
25、本发明第三方面提供了如本发明第一方面所述的基因工程菌或如本发明第二方面所述的构建方法构建获得的基因工程菌在生产灵芝酸dm中的应用。
26、在本发明的一些实施例中，所述应用包括将所述基因工程菌接入发酵培养基进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化获得灵芝酸dm。
27、优选地，所述发酵培养基包括ypd发酵培养基、ynb-ura/leu发酵培养基和ynb-ura/leu/trp发酵培养基中的一种或几种；
28、进一步优选地，所述发酵培养的温度为30℃；更进一步优选地，所述发酵培养的时间为168h。
29、本发明有益效果主要体现在：本发明首次实现了在酿酒酵母中生产灵芝酸dm，突破了灵芝酸dm来源的局限性，为实现灵芝酸的异源合成提供了新方法。本发明在酿酒酵母菌株ys58中，表达了cyp5150l8-cyp7a1-hsd3b7-7α-hsdh基因和过表达thmg1和/或idi1和/或erg20和/或erg12和/或upc2基因，构建酿酒酵母基因工程菌，有效地提高了酿酒酵母中灵芝酸dm在酿酒酵母体内的含量，使酿酒酵母基因工程菌的灵芝酸dm的产量达到118mg/l。
1.一种产灵芝酸dm的基因工程菌，其为表达外源性编码cyp450酶的cyp5150l8基因、编码7α-羟化酶的cyp7a1基因、编码3β-羟基类固醇脱氢酶的hsd3b7基因以及编码7α-羟基类固醇脱氢酶的7α-hsdh基因的重组酵母细胞。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，
3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述表达的方式为质粒表达或基因组整合表达。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为经过了底盘改造的基因工程菌；所述底盘改造包括前体合成途径的优化。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述前体合成途径的优化包括在重组酵母细胞中过表达内源性编码羟甲基戊二酰辅酶a还原酶的thmg1基因、编码异戊烯基二磷酸δ-异构酶的idi1基因、编码法尼基焦磷酸合成酶的erg20基因、编码甲羟戊酸激酶的erg12基因和内源性转录激活因子upc2基因中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述酵母细胞选自由以下酵母细胞构成的组：解脂耶氏酵母、红冬孢酵母、油脂酵母、产油油脂酵母、胶粘红酵母、弯曲隐球酵母、弯曲假丝酵母、发酵丝孢酵母、拉考夫假丝酵母、铁红假丝酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母、皮状丝孢酵母和酿酒酵母，优选为酿酒酵母。
8.一种如权利要求1-7中任意一项所述的基因工程菌的构建方法，其包括：构建重组酵母细胞a的步骤：以酵母细胞为底盘株表达外源性编码cyp450酶的cyp5150l8基因、编码7α-羟化酶的cyp7a1基因、编码3β-羟基类固醇脱氢酶的hsd3b7基因以及编码7α-羟基类固醇脱氢酶的7α-hsdh基因获得重组酵母细胞a。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括在构建重组酵母细胞a的步骤之后优化前体合成途径的步骤，其包括：
10.如权利要求1-7中任意一项所述的基因工程菌或如权利要求7-10中任意一项所述的构建方法构建获得的基因工程菌在生产灵芝酸dm中的应用；
