1.本发明属于微生物领域，涉及一种维氏气单胞菌及其产品和除氮用途。
背景技术：2.随着工农业的快速发展，工业中废水的排放和农业上大量农药的使用，导致水体中氮化合物含量迅速上升，造成了许多严重的环境问题，比如水酸化、富营养化、有毒藻类大量繁殖以及对水生动物的直接毒性。此外，还对人类健康产生负面影响，例如过量的硝酸盐会导致高铁血红蛋白血症和癌症。因此，从污水中去除氮具有重要意义。传统的生物脱氮包括硝化和反硝化两个阶段。然而，在自然环境中很难实现这样的系统，因为硝化需要有氧条件，而反硝化需要缺氧条件，这就导致了在空间和时间上难以统一。此外硝化过程中产生的酸需要加入碱中和，这就增加了处理成本，还可能造成二次污染。
3.好氧反硝化则成功解决了传统反硝化的缺陷，但仍然存在菌株难以定植在系统中易流失，以及耐受不了高浓度污染物和竞争不过本土菌株等问题。这些都会导致废水的脱氮效率降低，达不到理想的去除效果。
4.除了氮污染，重金属污染也已成为严重的环境问题。重金属是不可生物降解的，往往会在生物体内累积，而且已知许多重金属离子具有毒性或致癌性。在现代产业中，铜是需求量最大的重金属之一，被广泛用于机械、石化、电子、电镀、建筑、能源、养殖和通讯等行业，同时也是造成污染环境最严重的重金属之一。由于采矿、冶炼、养殖等行业污水的排放造成了铜对水生生态系统的污染，尤其在水产养殖中，硫酸铜是水产养殖中使用时间最长、应用最广泛的药物之一，这就不可避免的造成了铜对水的污染。此外，铜在动物新陈代谢中发挥着重要作用，但是过量摄入铜会导致严重的毒理学问题，包括呕吐、痉挛、抽搐，甚至死亡。并且，铜对反硝化也有着显著的消极影响。然而，适量的铜可以极大地减少n2o的生成，因为铜是n2o还原酶合成中必不可少的微量金属。有研究表明，菌株产生的胞外聚合物 (eps)有助于金属离子和有机污染物的吸附和粘附，因为它们结构中的疏水和亲水区域。此外，蛋白质羧基中氧原子的存在有助于吸附去除cu
2+
。因此，这类菌株的获得对于重金属污染的治理和一氧化二氮排放的减少具有重要意义。
5.好氧反硝化可以在同一个反应器中发生，大大减少了系统空间和成本，同时只需少量化学试剂来调节系统的ph，更为经济可行，并且处理运行也更容易调控。此外，生物膜形成是在废水处理中固定降解细菌的理想系统，因为生物膜高度结构化，细菌细胞嵌入基质中，从而保护细菌细胞免受环境压力或抗菌因素的影响。所以，获得一种具有强大生物膜形成能力同时能有效去除污染物的理想菌株为这一问题的解决提供了一种新方法。目前，还没有关于兼具高效自聚集和氮去除耐重金属的好氧反硝化菌的报道。
技术实现要素：6.为了解决上述问题，本发明提供了一种维氏气单胞菌yl-41菌株，具有好氧反硝化的功能，可直接将硝氮转化为气体产物，同时去除铜离子的效率高；应用于污水处理中，使
用方便，操作简单，降低了污水处理成本。
7.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
8.首先，提供了一种维氏气单胞菌菌株，所述的维氏气单胞菌菌株为维氏气单胞菌yl-41 菌株，保藏编号为cctcc no:m20211102，拉丁学名为aeromonas veronii yl-41，于2021 年8月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国湖北省武汉市。
9.进一步地，提供了一种包括所述维氏气单胞菌菌株的制备物。
10.进一步地，所述制备物的类型为培养物、培养物提取物、冻干粉、发酵液、发酵液沉淀、发酵液上清、发酵液提取物的任意一种。
11.进一步地，所述的冻干粉中包括维氏气单胞菌yl-41，还可能包括冻干保护剂。
12.进一步地，所述的冻干保护剂可以是多羟基化合物、糖、蛋白质、聚合物、氨基酸、盐、胺、表面活性剂中的一种或几种。
13.进一步地，提供了一种所述维氏气单胞菌菌株的培养方法，包括将所述维氏气单胞菌菌株接种于培养基。
14.进一步地，所述培养基具体为富集培养基(dbm)、btb平板培养基(btb)和除氮能力测试培养基(nr)。
15.进一步地，所述培养方法中培养基氮浓度50-100mg/l，碳氮比5-30，ph值7-8，培养温度25-35℃，在需氧条件下进行。
16.进一步地，所述培养方法包括如下步骤：取出保存的纯菌株样品备用；配制反硝化培养基，121℃灭菌后备用；将纯菌株样品接种至无菌的反硝化培养基；放入培养箱中，待菌株扩培完成。
17.在一些具体的实施方式中，所述培养方法包括如下步骤：取出保存的纯菌株样品备用；配制反硝化培养基，121℃灭菌后备用；在超净工作台中将纯菌株样品接种至无菌的反硝化培养基；放入培养箱中，等待菌株扩培完成。
18.进一步地，提供了一种包括所述维氏气单胞菌菌株的菌剂。
19.优选地，所述的菌剂可以通过维氏气单胞菌yl-41的培养物或冻干粉进行制备。
20.进一步地，提供了一种包括所述维氏气单胞菌菌株或所述制备物的污水处理剂。
21.优选地，所述污水处理剂包括所述维氏气单胞菌菌株培养至对数期的培养物。
22.进一步地，提供了一种污水处理方法，包括向污水中加入所述的维氏气单胞菌菌株。
23.进一步地，所述的维氏气单胞菌菌株或所述的制备物在污水处理中的应用。
24.进一步地，上述所述应用中将菌种扩大化培养后加入污水，或将菌种直接加入污水。
25.进一步地，上述所述应用中所述的维氏气单胞菌菌株培养至对数期后将培养物加入污水中。
26.进一步地，所述的培养物的接种量为1％-5％。
27.优选地，所述的培养物的接种量为1％-3％，更优选地，所述的培养物的接种量为2％。
28.进一步地，所述接种量为菌株占培养基的体积百分含量。
29.进一步地，所述污水可以是生产污水或生活污水，所述生产污水包括工业污水、农
业污水以及医疗污水。
30.进一步地，所述污水包括较高浓度的硝氮和/或铜离子。
31.进一步地，所述污水为氮含量高的污水。
32.优选地，所述污水为化工行业使用硝酸盐材料作为原料或者氧化剂产生的废水，牲畜饲料厂使用硝酸盐或者亚硝酸盐作为抗氧化剂产生的废水；炼油、铁合金等产生含有大量氨氮的废水经氧化或硝化后生成高浓度硝态氮的污水。
33.相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：
34.(1)本发明的维氏气单胞菌菌株aeromonasveroniiyl-41能够利用不同的氮源进行生长，以硝氮为唯一氮源时，在36h时硝氮的去除率达到97％和1.402mg/l/h，高于已报道的rhodococcussp.cpz24
1.(67％，0.93mg/l/h)，并且没有氨氮和亚硝氮的积累；以氨氮为唯一氮源时，在36h时氨氮的去除率达到99％和1.561mg/l/h，这与已报道的pannonibacterphragmitetusb1
2.(98％，1.16mg/l/h)情况相似，也没有硝氮和亚硝氮的积累；以亚硝氮为唯一氮源时，在36h亚硝氮的去除率达到99％和1.561mg/l/h，没有硝氮和氨氮的积累。
35.文献出处：
36.[1]p.chen,j.li,q.x.li,y.wang,s.li,t.ren,l.wang,simultaneousheterotrophicnitrificationandaerobicdenitrificationbybacteriumrhodococcussp.cpz24,bioresourtechnol.116(2012)266
–
270.
[0037]
[2]h.bai,s.liao,a.wang,j.huang,w.shu,j.ye,high-efficiencyinorganicnitrogenremovalbynewlyisolatedpannonibacterphragmitetusb1,bioresourtechnol.271(2019)91
–
99.
[0038]
(2)本发明提供的维氏气单胞菌菌株yl-41可同时实现脱氮和去除铜离子的功能，与此同时该菌株还具有良好的自聚集能力和疏水性，最高可分别达到76.4％和69.5％。同时可以做到使用方便，操作简单，降低了污水处理成本。该菌株yl-41可制作成新型微生态菌剂，具有良好的复合废水处理应用前景。
[0039]
保藏说明
[0040]
中文名：维氏气单胞菌yl-41；
[0041]
拉丁学名：aeromonasveroniiyl-41；
[0042]
保藏号：cctccno:m20211102；
[0043]
保藏机构：中国典型培养物保藏中心；
[0044]
保藏地址：中国武汉武汉大学；
[0045]
保藏时间：2021年8月30日。
附图说明
[0046]
图1为维氏气单胞菌株16srdna基因构建的系统发育树；
[0047]
图2为维氏气单胞菌株yl-41氮通路相关基因的扩增图；
[0048]
图3为好氧培养下，菌株yl-41以硝氮为唯一氮源时的生长及硝氮、氨氮和亚硝氮的变化图；
[0049]
图4为好氧培养下，菌株yl-41以氨氮为唯一氮源时的生长及硝氮、氨氮和亚硝氮
的变化图；
[0050]
图5为好氧培养下，菌株yl-41以亚硝氮为唯一氮源时的生长及硝氮、氨氮和亚硝氮的变化图；
[0051]
图6为好氧培养下，维氏气单胞菌株yl-41的胞外聚合物含量变化；
[0052]
图7为好氧培养下，维氏气单胞菌株yl-41的自聚集指数变化；
[0053]
图8为好氧培养下，不同铜离子浓度对维氏气单胞菌株yl-41硝氮去除率的影响；
[0054]
图9为好氧培养下，维氏气单胞菌株yl-41在不同时间下对不同铜离子浓度的去除效果。
具体实施方式
[0055]
值得说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，对其来源不做具体限定。
[0056]
菌株筛选：
[0057]
菌株选自合肥污水处理厂，在筛选中所用的培养基包括富集培养基(dbm)、btb平板培养基(btb)、除氮能力测试培养基(nr)。
[0058]
富集培养基(dbm)(每升培养基中各成分的量)：kno
3 5.0g、六水合丁二酸钠16.67g、 kh2po
4 1.5g、na2hpo4·
12h2o 10.55g、mgso
4 0.1g、nh4cl 0.3g、微量元素2ml(微量元素组成(g
·
l-1
)：fecl2·
4h2o 1.8、cocl2·
6h2o 0.25、nicl2·
6h2o 0.01、cucl2·
2h2o 0.01、mncl2·
4h2o 0.70、zncl
2 0.1、h3bo
3 0.5、na2moo4·
2h2o 0.03、na2seo3·
5h2o 0.01)，ph7.0。
[0059]
btb平板培养基(btb)(每升培养基中各成分的量)：kno
3 1.0g、柠檬酸三钠8.5g、 kh2po
4 1.0g、feso4·
7h2o 0.05g、cacl
2 0.2g、mgso4·
7h20 1.0g、1％溴百里酚蓝1ml、琼脂20g，ph 7.0-7.3。
[0060]
除氮能力测试培养基(nr)(每升培养基中各成分的量)：六水合丁二酸钠16.67g、 kh2po41.5g、na2hpo4·
12h2o 5.27g、mgso
4 0.1g、kno
3 0.361g、微量元素(组成同富集培养基)2ml，ph 7.0。
[0061]
取1ml静置的污泥接种于100ml的dbm中，于30℃，120rpm摇床培养。培养4天后取5ml培养液接种于新的100ml dbm中，如此富集培养4轮。取培养液并8倍梯度稀释，然后均匀涂布于btb平板培养基上，于30℃恒温培养箱中培养。直到培养基上长出有蓝色晕环的单菌落，随后挑取上述单菌落接种于除氮能力测试培养基(nr)内，于30℃， 120rpm摇床培养，比较各菌株对培养液中no
3-‑
n和tn的去除效率，选取去除效率较高的培养液进行平板划线，重复三次，最终选择对no
3-‑
n和tn去除效率最好的一株作为目标菌株。
[0062]
实施例1菌株的鉴定
[0063]
16s rdna扩增采用通用引物8f(seq id no.1)和1492r(seq id no.2)。
[0064]
获得pcr扩增结果，yl-41基因序列共1381bp(seq id no.3)，保存在genbank数据库中，登录号为mz853939，blast比对结果表明菌株yl-41与维氏气单胞菌(aeromonasveronii)的16s rdna基因序列相似度为100％。图1为菌株yl-41基于邻接法和genbank 数据库建立的系统发育树。
[0065]
实施例2反硝化关键酶基因的扩增
[0066]
对反硝化相关的关键酶基因nirs、norr、nosz和napa进行扩增，扩增引物见表1，扩
增体系为2
×
estaqmastermix12.5ul，上游引物和下游引物各1.0μl，模板0.5μl，ddwater10μl，扩增条件为，首先95℃预变性5min，然后进行35个循环：94℃变性30s，退火1min(nirs为57℃，norr为59℃，nosz为58℃，napa为69℃)，然后72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。测序由武汉艾康健生物科技有限公司完成。
[0067]
图2为扩增的凝胶电泳图，其中m表示marker(dna分子标记)，napa表示硝酸还原酶，nirs表示亚硝酸还原酶，norr表示一氧化氮还原酶，nosz表示一氧化二氮还原酶。结果显示与反硝化相关的关键酶基因均扩增成功，证明菌株yl-41具有完整的反硝化氮通路no
3-‑n→
no
2-‑n→
no
→
n2o
→
n2。
[0068]
表1反硝化关键酶基因扩增引物
[0069][0070]
实施例3氮平衡分析
[0071]
将菌株按2％(v/v)接种到装有100mldbm的250ml烧瓶中，并用不透气的橡胶塞密封，设置不接种的烧瓶为实验的空白对照。随后将全部烧瓶抽空并用纯氧(99.99％)曝气，以确保菌株的生长环境为好氧环境。为防止瓶内气体逸出，曝气完成后立即用封口膜将瓶口密封。然后将烧瓶全部置于恒温培养箱内，于30℃条件下培养36h后。通过检测tn、no
3-‑
n、no
2-‑
n、nh
4+-n和胞内氮来测定底物的消耗。有机氮是通过从tn中减去no
3-‑
n、no
2-‑
n和nh
4+-n来计算的。同时，抽取烧瓶顶部空间的气体样品，用于检测n2o和n2。每个实验均设置三组平行实验。
[0072]
表2为菌株yl-41氮平衡分析结果，其中初始氮有31.6％转化为胞内氮，16.2％以有机氮的形式存在，8.1％转化为n2o，31.2％转化为n2。大部分的氮都转化为胞内氮和气态氮，这与已报道的施式假单胞菌t1
[3]
和弧菌属ad2
[4]
一致。
[0073]
文献出处：
[0074]
[3]l.guo,q.chen,f.fang,z.hu,j.wu,a.miao,l.xiao,x.chen,l.yang,applicationpotentialofanewlyisolatedindigenousaerobicdenitrifierfornitrateandammoniumremovalofeutrophiclakewater,bioresourtechnol.142(2013)5
–
51.
[0075]
[4]j.ren,h.ma,y.liu,y.ruan,c.wei,j.song,y.wu,r.han,characterizationofanovelmarineaerobicdenitrifiervibriospp.ad2forefficientnitratereductionwithoutnitriteaccumulation,environscipollutresint.28(24)(2021)30807
–
30820.
[0076]
表2
[0077][0078]
实施例4氮去除能力测定
[0079]
分别制备50mg/l no
3-‑
n、50mg/l no
2-‑
n、50mg/l nh
4+-n为唯一氮源的氮测试培养基，其他成分与nr相同。取预先培养的处于对数期的细菌菌悬液50ml，8000rpm离心6min后弃去上清液，灭菌水重复洗涤三次后，用量筒定容至50ml。以2％(v/v)接种至有不同氮源的除氮能力测试培养基中。每个实验均设置三组平行实验，所有培养基均经过高压蒸汽灭菌。培养过程中，定时取样品测定od
600
和tn，再经离心后取上清液过0.22μm水系膜，测定no
3-‑
n、no
2-‑
n和nh
4+-n。
[0080]
结果显示在分别以硝氮、氨氮和亚硝氮为唯一氮源的培养基中，36h硝氮的去除率达到了97％，36h氨氮的去除率达到了99％，36h亚硝氮的去除率也达到99％，这说明菌株yl
‑ꢀ
41具有高效的脱氮性能(见图3、4、5)。
[0081]
实施例5胞外聚合物的测定
[0082]
将菌株按2％(v/v)接种到装有100ml氮测试培养基中，每隔6h接种一次，设置三组平行，于30℃，120rpm下培养。通过测定细菌粘附性指示细胞疏水性同时测定自聚集能力。采用阳离子交换树脂(cer，732钠型)法提取培养过程中产生的eps。用考马斯亮蓝法和蒽酮比色法分别测定蛋白质和多糖的含量。蛋白质和多糖的含量之和代表eps的总量。
[0083]
结果表明在36h时菌株eps的产生量达到最大，其中蛋白的含量远大于多糖(见图6)。自聚集能力和疏水性在36h时也都达到最大分别为76.4％和69.5％(见图7)。
[0084]
实施例6菌株yl-41对铜离子的耐受情况
[0085]
将培养至对数期的细菌悬浮液按2％(v/v)的接种量接种至氮测试培养基(分别含有20、 40、60和80mg/l的铜离子)，在温度25℃，摇床转速120r/min，培养72h，测定处理前后硝氮的含量变化，铜离子浓度在20mg/l时，硝氮的去除率为71.74％，随着铜离子浓度增加，硝氮的去除效率逐渐降低(见图8)。
[0086]
实施例7菌株yl-41对铜离子的去除效果
[0087]
将培养至对数期的细菌悬浮液按2％(v/v)的接种量接种至氮测试培养基(分别含有20、 40、60和80mg/l的铜离子)，在温度25℃，摇床转速120r/min下培养，分别在12、24、36、 48h时取样，测定铜离子含量变化。结果显示初始铜离子浓度在20、40、60和80mg/l，去除效率最高都分别达到86.3％、92.9％、95.6％、96.9％(见图9)。
[0088]
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
技术特征：1.一种维氏气单胞菌菌株，其特征在于，保藏编号为cctcc no:m20211102，拉丁学名为aeromonas veronii yl-41，于2021年8月30日保藏于中国典型培养物保藏中心。2.包括权利要求1所述的维氏气单胞菌菌株的制备物。3.根据权利要求2所述的制备物，其特征在于，所述制备物的类型为培养物、培养物提取物、冻干粉、发酵液、发酵液沉淀、发酵液上清、发酵液提取物的任意一种。4.权利要求1所述的维氏气单胞菌菌株的培养方法，其特征在于，包括将所述的维氏气单胞菌菌株接种于培养基。5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，培养基氮浓度50-100mg/l，碳氮比5-30，ph值7-8，培养温度25-35℃，在需氧条件下进行。6.根据权利要求4-5任一项所述的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：取出保存的纯菌株样品备用；配制反硝化培养基，121℃灭菌后备用；将纯菌株样品接种至无菌的反硝化培养基；放入培养箱中，待菌株扩培完成。7.包括权利要求1所述的维氏气单胞菌菌株的菌剂。8.包括权利要求1所述的维氏气单胞菌菌株或权利要求2-3任一项所述的制备物的污水处理剂。9.根据权利要求8所述的污水处理剂，其特征在于，包括权利要求1所述的维氏气单胞菌菌株培养至对数期的培养物。10.一种污水处理方法，其特征在于，包括向污水中加入权利要求1所述的维氏气单胞菌菌株。11.权利要求1所述的维氏气单胞菌菌株或权利要求2-3任一项所述的制备物在污水处理中的应用。12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，将菌种扩大化培养后加入污水，或将菌种直接加入污水。13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的维氏气单胞菌菌株培养至对数期后将培养物加入污水中。14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述的培养物的接种量为1％-5％。15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述的培养物的接种量为1％-3％。
技术总结本发明公开了一种维氏气单胞菌菌株，拉丁学名为Aeromonas veronii YL-41，保藏号为CCTCC NO:M20211102，于2021年8月30日保藏于湖北省武汉市的中国典型培养物保藏中心。所述维氏气单胞菌菌株YL-41可实现脱氮和去除铜离子，具有良好的自聚集特性，且使用方便，操作简单，降低了污水处理成本；该菌株YL-41可制作成新型微生态菌剂，具有良好的复合废水处理应用前景。前景。前景。
技术研发人员：洪培 张沿城 疏义林 吴海龙
受保护的技术使用者：安徽师范大学
技术研发日：2022.06.08
技术公布日：2022/11/1
