本发明涉及酶工程，尤其涉及一种生产稀有人参皂苷ck的β-葡萄糖苷酶突变体及其应用。
背景技术：
1、稀有人参皂苷ck在人体健康领域展现出多种重要的生物活性和药理作用。常用的稀有人参皂苷转化方法有物理法(微波、加热等)、化学法(酸水解、碱水解等)、生物转化法。物理化学法操作简单，适合工业生产，但不能选择性水解糖基，且反应剧烈，极易引起副反应并产生诸多副产物。生物转化法主要包括酶催化反应和微生物转化。酶转化法以含量高的固有人参皂苷为底物，使用特定的酶逐级水解单糖残基，具有选择性高、反应条件温和、转化率高等优点。微生物法能够在可控的发酵条件下转化多种底物，成本较低且常能产生复杂的酶系。
2、目前，研究者通过筛选具有高效转化能力的微生物菌株，如特定种类的细菌、真菌等，利用其发酵过程中产生的酶系对人参皂苷进行转化。已有多种微生物被证实具有转化人参皂苷为稀有人参皂苷ck的能力，同时已经成功分离出多种具有转化人参皂苷能力的酶，如α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等。然而，利用微生物发酵以制备人参皂苷ck的过程中，对于水质要求高、对温度、ph等环境因素敏感、对有毒物质敏感，厌氧反应器启动时间长，反应过程较为复杂，需要严格控制各种反应条件，难以实现工业化生产，不同批次所制备得到人参皂苷ck质量不稳定，同时部分微生物还需要通过iptg诱导表达，而iptg的残留可能会对人体造成危害。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种生产稀有人参皂苷ck的β-葡萄糖苷酶突变体及其应用。
2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
3、第一方面，本发明提供了一种生产稀有人参皂苷ck的β-葡萄糖苷酶突变体，所述β-葡萄糖苷酶突变体与seq id no.1具有至少90％的核苷酸序列一致性，且包含以下至少一个的突变：所述β-葡萄糖苷酶突变体的突变位点包括seq id no.1的第229、232位中的至少一个或者对应的位置，在所述的突变位点上发生取代、插入或删除一个或多个氨基酸残基。
4、本发明通过对现有的β-葡萄糖苷酶的保守结构域进行差异分析，并根据报道过的活性中心，确定来源于嗜糖黄杆菌的β-葡萄糖苷酶sa0236的突变位点为229和232，通过基因编辑技术进行定点突变制备得到β-葡萄糖苷酶突变体，能够显著提高人参皂苷rb1转化为人参皂苷ck的效率，同时还能够以人参皂苷rd作为前体转化得到人参皂苷ck。
5、作为本发明所述β-葡萄糖苷酶突变体的优选实施方式，所述突变为取代突变，包含以下至少一个氨基酸残基的取代：
6、第229位异亮氨酸取代苯丙氨酸；或
7、第232位缬氨酸取代谷氨酸。
8、作为本发明所述β-葡萄糖苷酶突变体的优选实施方式，所述突变为包含第220位异亮氨酸取代苯丙氨酸和第232位缬氨酸取代谷氨酸。
9、第二方面，本发明提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述β-葡萄糖苷酶突变体。
10、第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括上述多核苷酸。
11、第四方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞包括上述多核苷酸或表达载体。
12、作为本发明所述重组细胞的优选实施方式，所述重组细胞包括大肠杆菌。
13、第五方面，本发明提供了上述β-葡萄糖苷酶突变体在制备稀有人参皂苷ck中的应用。
14、第六方面，本发明提供了上述重组细胞在制备稀有人参皂苷ck中的应用。
15、第七方面，本发明提供了一种人参皂苷ck的生产工艺，包括以下步骤：将上述β-葡萄糖苷酶突变体与人参皂苷ck的前体进行反应，得到人参皂苷ck。
16、作为本发明所述生产工艺的优选实施方式，所述人参皂苷ck的前体包括人参皂苷rb1、人参皂苷rd和人参皂苷f2中的至少一种。
17、与现有技术相比，本发明的有益效果为：
18、1、本发明通过对现有的β-葡萄糖苷酶的保守结构域进行差异分析，并根据报道过的活性中心，确定来源于嗜糖黄杆菌的β-葡萄糖苷酶sa0236的突变位点为229和232，通过基因编辑技术进行定点突变制备得到β-葡萄糖苷酶突变体，能够显著提高人参皂苷rb1转化为人参皂苷ck的效率，同时还能够以人参皂苷rd作为前体转化得到人参皂苷ck。
19、2、本发明所制备得到的β-葡萄糖苷酶突变体的人参皂苷ck转化率高、反应条件温和，适合用于人参皂苷ck的工业化生产。
1.一种生产稀有人参皂苷ck的β-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶突变体与seq id no.1具有至少90％的核苷酸序列一致性，且包含以下至少一个的突变：所述β-葡萄糖苷酶突变体的突变位点包括seq id no.1的第229、232位中的至少一个或者对应的位置，在所述的突变位点上发生取代、插入或删除一个或多个氨基酸残基。
2.如权利要求1所述β-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变为取代突变，包含以下至少一个氨基酸残基的取代：
3.如权利要求1或2所述β-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变为包含第220位异亮氨酸取代苯丙氨酸和第232位缬氨酸取代谷氨酸。
4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1-3任一项所述的β-葡萄糖苷酶突变体。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括如权利要求4所述多核苷酸或如权利要求5所述的表达载体。
7.如权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括大肠杆菌。
8.如权利要求1-3任一项所述的β-葡萄糖苷酶突变体在制备稀有人参皂苷ck中的应用。
9.如权利要求6所述的重组细胞在制备稀有人参皂苷ck中的应用。
10.一种人参皂苷ck的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1-3任一项所述β-葡萄糖苷酶突变体与人参皂苷ck的前体进行反应，得到人参皂苷ck。
