本发明属于肿瘤原代细胞培养，具体涉及一种泌尿系肿瘤原代细胞的培养方法。
背景技术：
1、随着医学和生物技术的不断进步，泌尿系肿瘤的治疗与研究面临着巨大的挑战和机遇。泌尿系肿瘤原代细胞的培养作为研究肿瘤生物学特性、基因功能和药物反应性的重要手段，对于理解肿瘤发展机制、发现新的治疗靶点以及评估治疗效果具有至关重要的作用。
2、传统的泌尿系肿瘤原代细胞培养方法往往存在细胞存活率低、稳定性差、难以模拟肿瘤微环境等问题，限制了其在肿瘤研究中的应用。为了克服这些限制，发明人提出一种泌尿系肿瘤原代细胞的培养方法，用以解决上述问题。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种泌尿系肿瘤原代细胞的培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、一种泌尿系肿瘤原代细胞的培养方法，包括以下步骤：
4、s1、组织样本采集和处理，从手术中获取泌尿系肿瘤组织，将组织放入含冷pbs的无菌容器中，并迅速送至实验室；
5、s2、组织消化和细胞分离，在生物安全柜中，将组织转移到新的无菌培养皿中，用冷pbs清洗去除血液和碎片；将组织剪成1～2mm3体积的块状，加入消化液，37℃，60～100rpm条件下，搅拌1～2小时，在搅拌的最后15分钟加入tryps i n-edta进行细胞解离；
6、s3、细胞收集和培养，将消化液过滤，用rpm i-1640培养基中和，离心收集细胞沉淀，重悬细胞，将细胞悬液接种于胶原蛋白涂层的培养瓶中，将培养瓶置于氧气培养箱中，模拟肿瘤组织中的氧气环境，促进细胞生长和适应；
7、s4、基因编辑和功能研究，使用crispr-cas9系统进行特定基因的编辑，设计sgrna并转染细胞，筛选编辑成功的细胞群体；
8、s5、3d培养模型的建立，在低附着力培养皿中培养细胞形成3d球体，观察其在三维结构中的行为和药物反应；
9、s6、单细胞分析和细胞异质性研究，使用流式细胞仪技术分离单个细胞，进行单细胞rna测序，即scrna-seq分析，研究细胞异质性及其在肿瘤中的功能表现；
10、s7、培养和传代，每2～3天更换培养基，根据细胞生长情况进行传代，保持细胞的活力和稳定性。
11、优选的，s2中所述消化液组成为1～2mg/ml的胶原酶ⅳ型co l l agenase iv和0.25％浓度的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸tryps i n-edta组成。
12、优选的，s3中离心的条件为12000～15000rpm，10～15秒。
13、优选的，s3中氧气培养箱的参数为1％～5％o2浓度，温度4～35摄氏度。
14、优选的，s3中消化液过滤手段为使用70μm细胞过滤器进行过滤。
15、优选的，s3中rpmi-1640培养基含10％胎牛血清fbs和1％青霉素-链霉素。
16、优选的，s4中sgrna设计步骤如下：
17、选择pam序列：明确要编辑的目标基因及其位置，在cas9蛋白识别基因组dna上的pam(protospacer adjacentmot if)序列，为ngg；
18、设计sgrna序列：针对目标基因序列和pam序列，使用在线sgrna设计工具或参考已有文献来设计sgrna，确保sgrna序列与目标基因的外显子公共区匹配，并靠近起始密码子，每个基因设计10条sgrna，以增加编辑的成功率；对于某个特定的基因，设计了5条sgrna，sgrna1至sgrna5，每条sgrna针对该基因的不同位置。
19、优选的，s4中sgrna合成与转染步骤如下：
20、合成sgrna：利用化学合成平台高效合成sgrna，确保序列100％正确且具有功能性蛋白敲除能力，为了提高sgrna的稳定性和降低脱靶效应，在sgrna的5'和3'端各加3个硫代和甲氧基修饰；
21、构建sgrna文库：将设计好的sgrna合成o l igo poo l，然后通过富集和克隆，构建到crispr载体中；
22、转染细胞：选择适合的细胞类型和培养条件，将构建好的crispr质粒文库包装到慢病毒中，用于下游的细胞侵染实验。
23、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
24、(1)本发明使用胶原蛋白涂层培养瓶和适应的培养基配方，有助于维持泌尿系肿瘤原代细胞的健康状态，保证其在培养过程中的稳定性和可重复性；通过低氧培养条件，模拟肿瘤组织内的低氧环境，促进细胞的生长和适应性，使得培养的细胞更符合实际肿瘤微环境的特征。
25、(2)本发明利用crispr-cas9系统进行基因编辑，可以精确地研究特定基因的功能和调控机制，揭示肿瘤发展中的关键基因和途径；建立3d球体模型有助于更真实地模拟肿瘤组织的结构和生长方式，提供更准确的药物筛选平台和生物学行为评估。
26、(3)本发明通过单细胞rna测序等技术，可以深入分析泌尿系肿瘤细胞群体中的细胞异质性，识别不同亚群的表型和分子特征，为个性化治疗和靶向治疗提供基础；对不同药物的敏感性和抗药性进行测试，有助于筛选有效的治疗药物并评估治疗方案的有效性，为临床应用提供实验依据。
1.一种泌尿系肿瘤原代细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种泌尿系肿瘤原代细胞的培养方法，其特征在于：s2中所述消化液组成为1～2mg/ml的胶原酶ⅳ型collagenase iv和0.25％浓度的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸trypsin-edta组成。
3.根据权利要求1所述的一种泌尿系肿瘤原代细胞的培养方法，其特征在于：s3中离心的条件为12000～15000rpm，10～15秒。
4.根据权利要求1所述的一种泌尿系肿瘤原代细胞的培养方法，其特征在于：s3中氧气培养箱的参数为1％～5％o2浓度，温度4～35摄氏度。
5.根据权利要求1所述的一种泌尿系肿瘤原代细胞的培养方法，其特征在于：s3中消化液过滤手段为使用70μm细胞过滤器进行过滤。
6.根据权利要求1所述的一种泌尿系肿瘤原代细胞的培养方法，其特征在于：s3中rpmi-1640培养基含10％胎牛血清fbs和1％青霉素-链霉素。
7.根据权利要求1所述的一种泌尿系肿瘤原代细胞的培养方法，其特征在于：s4中sgrna设计步骤如下：
8.根据权利要求1所述的一种泌尿系肿瘤原代细胞的培养方法，其特征在于：s4中sgrna合成与转染步骤如下：
