本发明属于动物传染病病原体分子检测，具体涉及一种能够检测并鉴别布鲁氏菌疫苗a19株、疫苗s2株、疫苗m5株和野毒株单独阳性或混合阳性的试剂盒及其检测方法。
背景技术：
1、布鲁氏菌病（brucellosis），简称布病，是我国《一、二、三类动物疫病病种名录》中规定的二类动物疫病，其是由是由布鲁氏菌（ brucella ）引起的一种人兽共患传染病，以发热和流产为主要病征，流行于170多个国家和地区，对畜牧业发展和人畜健康构成较大威胁。
2、布鲁氏菌是革兰氏阴性兼性厌氧菌，属兼性胞内病原体。根据其生化特性、抗原成分、宿主特异性和对宿主致病性，可将布鲁氏菌分为10个种。其中，羊种、绵羊种、牛种、猪种、犬种和鼠种布鲁氏菌为经典种，共有20个生物型。
3、布鲁氏菌的分离培养是诊断布病的“金标准”。但由于布鲁氏菌对环境和营养要求较高，分离培养过程复杂，需要专业技术人员在生物安全三级以上实验室操作，培养过程存在较高的生物安全风险。因此，布鲁氏菌的分离培养不适合用于现场疫情筛查和临床快速检测。
4、目前，动物布病的临床常用检测技术是各种血清学方法，有常规血清学试验、补体结合试验（cft）、酶联免疫吸附试验（elisa）和荧光偏振试验（fpa）等。虽然布病血清学检测方法众多，但在国际上尚未有标准方法。而且，由于疫苗免疫产生的抗体与野毒株感染产生的抗体相似，因此各种血清学方法均难以准确区分，这也限制了“免疫净化”政策的推广。
5、实时荧光定量pcr技术，是目前检测样品中特定核酸最敏感、最准确的方法之一，即可定性检测，也可定量检测，且检测结果可重复性好。目前，实时荧光定量pcr检测过程已经逐步自动化，大幅简化操作步骤，缩短了检测时间。凭借上述优势，实时荧光定量pcr技术在病原检测和种型鉴别等方面应用日益广泛。
6、2022年，农业农村部印发了《畜间布鲁氏菌病防控五年行动方案（2022—2026年）》，为布病防控确立了目标并制定了基本原则、主要目标和措施，不断推进全国布病防治、监测和净化，但受疫源分布广、活畜流动性大、病畜精准诊断难度大等因素影响，我国布病疫情仍然严重，防控形势十分严峻。
7、疫苗免疫预防是防控动物布病的重要策略。目前，国内应用的布鲁氏菌疫苗主要是牛种a19株、猪种s2株和羊种m5株三种活疫苗。上述三种疫苗之间由于各疫苗的免疫效果和适用动物的生长阶段各有不同，故同一养殖场内会交叉使用多种疫苗，不可避免地导致不同疫苗，以及疫苗和野毒菌株的混合阳性。因此，建立能够鉴别布鲁氏菌不同疫苗株、野毒株及其不同菌株混合阳性的检测技术，对于布病的净化及控制具有较为重要的意义。
8、鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供能够同时鉴别布鲁氏菌疫苗株a19、疫苗株s2、疫苗株m5、野毒株以及不同菌株混合阳性的方法和检测试剂盒、以及该鉴别检测试剂盒的应用。
技术实现思路
1、发明人经过深入研究，认识到开发能够同时鉴别布鲁氏菌疫苗株a19、疫苗株s2、疫苗株m5以及野毒株的核酸检测试剂盒的难点在于：虽然通过基因组比较分析，可以发现布鲁氏菌单一疫苗株与其他菌株的差异序列，进而应用分子生物学的技术，如实时荧光定量pcr技术进行检测区分。但是，同时鉴别上述三种疫苗株时，由于三种疫苗株与野毒株之间缺乏单一的特异序列，故需要检测多个基因序列，才能对三种疫苗株与野毒株进行区分。另一方面，由于某一疫苗株的特异序列，对应其他疫苗株与野毒株之间的序列可能是一致的，非疫苗株特异的，故若仅针对疫苗株的基因序列进行检测，则无法判定是否存在野毒株；反之，若仅针对野毒株的基因序列进行检测，则会混淆疫苗株混合阳性与野毒株阳性。
2、为了攻克上述难点，本发明提供了一套鉴别布鲁氏菌的探针和引物组合、试剂盒以及检测方法，同时对疫苗株和野毒株进行扩增检测，通过不同的探针信号组合，实现对单纯疫苗株阳性、单纯野毒株阳性、疫苗株与野毒株混合阳性、不同疫苗株混合阳性等情况进行鉴别。
3、本发明的技术方案如下：
4、本发明提供了一种用于同时鉴别布鲁氏菌疫苗a19株、疫苗s2株、疫苗m5株和野毒株的探针与引物组合，所述探针包括：
5、探针a，包括seq id no.1～seq id no.3所示核苷酸序列的探针的任一种或多种；
6、探针b，包括seq id no.4～seq id no.6所示核苷酸序列的探针的任一种或多种；
7、探针c，包括seq id no.7～seq id no.8所示核苷酸序列的探针的任一种或多种；
8、探针d，包括seq id no.9～seq id no.10所示核苷酸序列的探针的任一种或多种；
9、所述探针的5’端标记荧光发光基团，3’端标记荧光淬灭基团。进一步地，所述的荧光发光基团包括但不限于fam、vic、hex、rox、cy5，荧光淬灭基团包括但不限于bhq1、bhq2、bhq3、mgb；
10、所述的引物包括seq id no.11～seq id no.20所示核苷酸序列的引物的任一种或多种。
11、seq id no.1：5’-cccaccgtataaagcccg-3’
12、seq id no.2：5’-tcgagatttcagatttcagaa-3’
13、seq id no.3：5’-ttacgatacgaccctgcg-3’
14、seq id no.4：5’-cccaccgcgtataaagcccg-3’
15、seq id no.5：5’-cgtcgagatttcagaaccggcatc-3’
16、seq id no.6：5’-atctacgacacgaccccg-3’
17、seq id no.7：5’-attgcgaggtcgcacccgatattg-3’
18、seq id no.8：5’-ctcataaaaggctttcttc-3’
19、seq id no.9：5’-cacccgatcgaggtcgcacc-3’
20、seq id no.10：5’-tccaaggtcggctacgaacagcgt-3’
21、seq id no.11：5’-cagctcagaccccagatgcg-3’
22、seq id no.12：5’-catggcaggcattctgttcc-3’
23、seq id no.13：5’-cgaggcttccgccacca-3’
24、seq id no.14：5’-gaactctttcaggagacccgt-3’
25、seq id no.15：5’-gcacgcgagcgcatttat-3’
26、seq id no.16：5’-gctcttccaacagcgtgaca-3’
27、seq id no.17：5’-cgtctggccgatctttacg-3’
28、seq id no.18：5’-aagcgccatcagcggcag-3’
29、seq id no.19：5’-catccacactcgccagcaat-3’
30、seq id no.20：5’-cgatttgcgggtggttattcc-3’
31、本发明提供了一种用于鉴别布鲁氏菌疫苗a19株、疫苗s2株、疫苗m5株和野毒株的试剂盒，所述试剂盒包含上述探针与引物组合。
32、较佳的，上述试剂盒中，上述探针与引物组合被混合装于一个容器内。
33、较佳的，上述试剂盒中，包含核酸扩增试剂、阳性对照和阴性对照；其中，核酸扩增试剂包含上述探针与引物混合物。
34、本发明进一步公开了鉴别布鲁氏菌疫苗a19株、疫苗s2株、疫苗m5株和野毒株的试剂盒的使用方法，主要包括：
35、(1)使用核酸提取试剂提取待测样本的总核酸；
36、(2)使用权利要求4所述的检试剂盒，检测待测样本的总核酸，并收集探针a、探针b、探针c、探针d的荧光信号；
37、(3)结果判定：
38、a) 探针b和探针c呈阳性信号，探针a和探针d呈阴性信号，则待测样本含有布鲁氏菌疫苗a19株核酸；
39、b) 探针a和探针d呈阳性信号，探针b和探针c呈阴性信号，则待测样本含有布鲁氏菌疫苗s2株（或/和m5株）核酸；
40、c) 探针a和探针c呈阳性信号，探针b和探针d呈阴性信号，则待测样本含有布鲁氏菌野毒株核酸；
41、d) 探针a、探针b和探针c呈阳性信号，探针d呈阴性信号，则待测样本含有布鲁氏菌疫苗a19株核酸和野毒株核酸；
42、e) 探针a、探针c和探针d呈阳性信号，探针b呈阴性信号，则待测样本含有布鲁氏菌疫苗s2株（或/和m5株）核酸和野毒株核酸；
43、f) 探针a、探针b、探针c和探针d都呈阳性信号，则待测样本含有布鲁氏菌疫苗a19株核酸和疫苗s2株（或/和m5株）核酸，或者含有布鲁氏菌疫苗a19株核酸、疫苗s2株（或/和m5株）核酸和野毒株核酸；
44、g) 探针a、探针b、探针c和探针d都呈阴性信号，则待测样本不含有布鲁氏菌核酸。
1.用于同时鉴别布鲁氏菌疫苗a19株、疫苗s2株、疫苗m5株和野毒株的探针和引物组合，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的探针和引物组合，其特征在于，包括seq id no.11～seq idno.20所示核苷酸序列的引物的任一种或多种。
3.根据权利要求1所述的探针和引物组合，其特征在于，所述的探针5’端标记荧光发光基团，3’端标记荧光淬灭基团。进一步地，所述的荧光发光基团包括但不限于fam、vic、hex、rox、cy5，荧光淬灭基团包括但不限于bhq1、bhq2、bhq3、mgb。
4.一种用于鉴别布鲁氏菌疫苗a19株、疫苗s2株、疫苗m5株和野毒株的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述探针和引物组合。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，包含核酸扩增试剂、阳性对照和阴性对照；其中，所述核酸扩增试剂包含所述探针与引物混合物。
6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，包括如下使用步骤：
