本发明属于分子生物学标记，具体涉及mir-10386作为鉴定骨骼肌外泌体的分子标记及其验证方法。
背景技术：
1、骨骼肌是动物主要的肌肉组织，其生成受到复杂严密的调控。除了生肌调控因子和肌细胞增强因子外，其他基因和小rna(如microrna)也可做为调控分子参与骨骼肌发育过程。
2、microrna(mirna)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链rna分子，在动植物中参与转录后基因表达调控。大量研究表明，mirna调控骨骼肌的发育，主要表现在肌卫星细胞的激活及增殖、分化、肌管的形成等生物学过程。成肌细胞的增殖和分化是肌肉发育过程中的重要阶段，在这一阶段中mirnas发挥着重要影响。骨骼肌及其它组织中的mirna具有重要调控功能。近年来，研究逐渐发现外泌体作为一种重要的细胞间通讯介质，其中也含有丰富的mirnas。因此，关于骨骼肌外泌体及其中包被的mirnas的相关功能研究已逐渐成为当前的热点和焦点，但是目前未有针对骨骼肌外泌体进行鉴定的分子方法。以往通常是选用骨骼肌特异性表达的mirna，如mir-1、mir-133、mir-206等对骨骼肌组织实时荧光q-pcr定量确定组织类型，对骨骼肌组织进行鉴定。但是对外泌体的鉴定只能根据外泌体表面蛋白标记利用流式细胞术和蛋白质免疫印迹(western blot，wb)等技术对外泌体进行鉴定，导致无法对特定组织类型来源的外泌体进行鉴定。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的在于提供mir-10386作为鉴定骨骼肌外泌体的分子标记及其验证方法。
2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、发明提供了mir-10386作为鉴定骨骼肌外泌体的分子标记的用途。
4、进一步地，包括如下步骤，依次验证mir-10386能够在骨骼肌外泌体中特异性高表达、能促进成肌细胞增殖、能促进成肌细胞分化。
5、进一步地，mir-10386通过转录组测序在骨骼肌外泌体中实现特异性高表达。
6、进一步地，所述转录组测序的步骤包括：对不同来源的骨骼肌组织进行外泌体和总rna的分离，使用trizol ls从骨骼肌外泌体中提取总rna，使用trizol从骨骼肌中提取总rna，使用illumina hiseq 2500进行单端测序(36bp)，并对测序结果进行比较分析。
7、进一步地，促进成肌细胞增殖的实施过程为：成肌细胞在含有10％胎牛血清的dmem培养基中培养；在细胞增殖实验中，采用ribobiofecttmcp试剂转染，并评估细胞增殖情况；在转染后将成肌细胞暴露于10μm edu，随后进行孵育、edu染色，显微镜获取图像后进行图像分析。
8、进一步地，促进成肌细胞分化的实施过程为：当细胞达到80％融合度时，通过将培养基更换为含有2％马血清诱导其分化；转染mir-10386模拟物、抑制剂及其对应的阴性对照后6h，将培养基更换为分化培养基并进行一次转染，静置预设时间后收集细胞；成肌细胞的分化情况通过免疫荧光染色检测骨骼肌快纤维肌球蛋白重链和慢纤维肌球蛋白重链确定，通过荧光值的数量确定蛋白的表达量。
9、本发明的有益效果在于：
10、本发明研究发现mir-10386特异性在骨骼肌外泌体中特异性高表达，而在骨骼肌组织中表达量极低甚至不表达。根据细胞学功能研究试验发现mir-10386可以促进成肌细胞增殖和分化，调控骨骼肌的发育过程，因此可以将mir-10386作为鉴定骨骼肌外泌体的分子标记。
11、本发明的其他优点、目标和特征将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上对本领域技术人员而言是显而易见的，或者本领域技术人员可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
1.mir-10386作为鉴定骨骼肌外泌体的分子标记的用途。
2.根据权利要求1所述的mir-10386作为鉴定骨骼肌外泌体的分子标记的验证方法，其特征在于：包括如下步骤，依次验证mir-10386能够在骨骼肌外泌体中特异性高表达、能促进成肌细胞增殖、能促进成肌细胞分化。
3.根据权利要求2所述的mir-10386作为鉴定骨骼肌外泌体的分子标记的验证方法，其特征在于：mir-10386通过转录组测序在骨骼肌外泌体中实现特异性高表达。
4.根据权利要求3所述的mir-10386作为鉴定骨骼肌外泌体的分子标记的验证方法，其特征在于：所述转录组测序的步骤包括：对不同来源的骨骼肌组织进行外泌体和总rna的分离，使用trizol ls从骨骼肌外泌体中提取总rna，使用trizol从骨骼肌中提取总rna，使用illumina hiseq 2500进行单端测序(36bp)，并对测序结果进行比较分析。
5.根据权利要求2所述的mir-10386作为鉴定骨骼肌外泌体的分子标记的验证方法，其特征在于：促进成肌细胞增殖的实施过程为：成肌细胞在含有10％胎牛血清的dmem培养基中培养；在细胞增殖实验中，采用ribobiofecttmcp试剂转染，并评估细胞增殖情况；在转染后将成肌细胞暴露于10μm edu，随后进行孵育、edu染色，显微镜获取图像后进行图像分析。
6.根据权利要求2所述的mir-10386作为鉴定骨骼肌外泌体的分子标记的验证方法，其特征在于：促进成肌细胞分化的实施过程为：当细胞达到80％融合度时，通过将培养基更换为含有2％马血清诱导其分化；转染mir-10386模拟物、抑制剂及其对应的阴性对照后6h，将培养基更换为分化培养基并进行一次转染，静置预设时间后收集细胞；成肌细胞的分化情况通过免疫荧光染色检测骨骼肌快纤维肌球蛋白重链和慢纤维肌球蛋白重链确定，通过荧光值的数量确定蛋白的表达量。
