本技术涉及基因工程，特别涉及一种可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白及其制备方法与应用。
背景技术：
1、胶原蛋白是构成细胞外基质的主要成分之一，负责维持组织结构的稳定性和提供生物力学支持。天然胶原蛋白分子量较大，结构复杂，具有低温自组装的物理属性。重组胶原蛋白一般截取天然胶原蛋白其中一段氨基酸序列截短表达。目前，重组胶原蛋白因其优异的生物相容性和生物活性而在多个领域展现出应用潜力。但重组胶原蛋白也存在一些缺陷，一方面是其结构和功能与天然胶原蛋白存在差异，由于重组胶原蛋白在结构上与天然胶原蛋白存在差异，以及重组胶原蛋白氨基酸序列的变化和蛋白质加工修饰的不同，使得市场上绝大部分的重组胶原蛋白都不具有天然胶原蛋白特有的低温自组装属性；另一方面是重组胶原蛋白热稳定性差，容易降解，市场上大多数的重组胶原蛋白产品在高温条件下不够稳定，一般文献所报道的重组胶原蛋白熔点温度（tm值）在40℃-60℃，因而无法耐受高温乳化和灭菌的温度，这就限制了其在乳膏霜类化妆品中的应用，并且，在体内或高温环境条件下，稳定性差的重组胶原蛋白更容易被降解，不具有长效性。基于此，本技术提出一种可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白及其制备方法与应用。
技术实现思路
1、本技术的主要目的是提供一种可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白及其制备方法与应用，旨在解决现有的重组胶原蛋白不具有低温自组装属性和耐热稳定性的技术问题。
2、为实现上述目的，本技术提出了一种可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白，所述重组人源化胶原蛋白的基因序列如seq id no.19、seq id no.20、seq idno.21、seq id no.22、seq id no.23、seq id no.24、seq id no.25或seq id no.26所示。
3、本技术还提出了一种可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
4、基于人源ⅰ型胶原蛋白肽片段和人源ⅲ型胶原蛋白肽片段，设计不包含mmps主要酶切位点序列的重组人源化胶原蛋白氨基酸序列；
5、基于所述重组人源化胶原蛋白氨基酸序列，进行毕赤酵母密码子偏好性优化设计后，获得重组人源化胶原蛋白基因序列；
6、基于所述重组人源化胶原蛋白基因序列和毕赤酵母表达质粒pgapzαa，构建重组人源化胶原蛋白质粒；
7、以人源基因p4h作为脯氨酸羟化酶的氨基酸序列，根据毕赤酵母宿主密码子偏好性优化设计后，获得重组脯氨酸羟化酶的基因序列；
8、基于所述重组脯氨酸羟化酶的基因序列和毕赤酵母表达质粒ppic3.5k，构建重组脯氨酸羟化酶质粒；
9、对所述重组人源化胶原蛋白质粒进行酶切线性化，获得线性化重组人胶原蛋白质粒；将所述线性化重组人胶原蛋白质粒电转化至毕赤酵母gs115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组人胶原蛋白酵母工程菌；对所述重组脯氨酸羟化酶质粒进行酶切线性化，获得线性化重组脯氨酸羟化酶质粒；以所述重组人胶原蛋白酵母工程菌制备重组工程菌感受态细胞，将所述线性化重组脯氨酸羟化酶质粒电转化至所述重组工程菌感受态细胞，经过培养和共表达阳性转化子筛选，获得重组人胶原蛋白共表达脯氨酸羟化酶酵母工程菌；
10、对所述重组人胶原蛋白共表达脯氨酸羟化酶酵母工程菌进行诱导表达，离心收集发酵液上清；
11、将所述发酵液上清纯化处理后，获得重组人源化胶原蛋白原液。
12、可选地，所述基于人源ⅰ型胶原蛋白肽片段和人源ⅲ型胶原蛋白肽片段，设计不包含mmps主要酶切位点序列的重组人源化胶原蛋白氨基酸序列的步骤，包括：
13、将人源ⅰ型胶原蛋白肽片段和人源ⅲ型胶原蛋白肽片段首尾相连，构成野生型胶原蛋白肽，所述野生型胶原蛋白肽不包含mmps主要酶切位点；
14、以所述野生型胶原蛋白肽为基础，采用计算机辅助蛋白质设计法，进行结构模拟与能量计算，获得7种胶原蛋白肽突变体；
15、分别以所述野生型胶原蛋白肽和7种所述胶原蛋白肽突变体为基础单元重复串联4次后，获得如seq id no.11、seq id no.12、seq id no.13、seq id no.14、seq id no.15、seq id no.16、seq id no.17或seq id no.18所示的重组人源化胶原蛋白氨基酸序列。
16、可选地，所述mmps主要酶切位点包括-gly-|-ile-、-pro-gln-gly-|-ile-ala-gly-gln-、-asn/asp-|-leu-gly-|-ile-asn-|-phe-gln-|-thr、-ala-|-gln-、-ala-|-leu-和-tyr-|-leu-。
17、可选地，所述基于所述重组人源化胶原蛋白氨基酸序列，进行毕赤酵母密码子偏好性优化设计后，获得重组人源化胶原蛋白基因序列的步骤，包括：
18、根据如seq id no.11、seq id no.12、seq id no.13、seq id no.14、seq idno.15、seq id no.16、seq id no.17或seq id no.18所示的重组人源化胶原蛋白氨基酸序列，分别在c端添加终止子，进行毕赤酵母密码子偏好性优化设计后，获得如seq id no.19、seq id no.20、seq id no.21、seq id no.22、seq id no.23、seq id no.24、seq id no.25或seq id no.26所示的重组人源化胶原蛋白基因序列。
19、可选地，所述基于所述重组人源化胶原蛋白基因序列和毕赤酵母表达质粒pgapzαa，构建重组人源化胶原蛋白质粒的步骤，包括：
20、根据如seq id no.19、seq id no.20、seq id no.21、seq id no.22、seq idno.23、seq id no.24、seq id no.25或seq id no.26所示的重组人源化胶原蛋白基因序列分别进行基因片段合成，并将合成的基因片段分别插入毕赤酵母表达质粒pgapzαa上的酶切位点xho ⅰ和not ⅰ之间，获得重组人源化胶原蛋白质粒。
21、可选地，所述以人源基因p4h作为脯氨酸羟化酶的氨基酸序列，根据毕赤酵母宿主密码子偏好性优化设计后，获得重组脯氨酸羟化酶的基因序列的步骤中，所述重组脯氨酸羟化酶的基因序列如seq id no.28所示。
22、可选地，所述基于所述重组脯氨酸羟化酶的基因序列和毕赤酵母表达质粒ppic3.5k，构建重组脯氨酸羟化酶质粒的步骤，包括：
23、根据如seq id no.28所示的重组脯氨酸羟化酶的基因序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入毕赤酵母表达质粒ppic3.5k上的酶切位点ecor ⅰ和not ⅰ之间，获得重组脯氨酸羟化酶质粒。
24、可选地，所述对所述重组人源化胶原蛋白质粒进行酶切线性化，获得线性化重组人胶原蛋白质粒的步骤，包括：
25、采用quickcut sacⅰ对所述重组人源化胶原蛋白质粒进行酶切线性化处理，酶切温度为37℃，酶切时间为5h，再加入3m naac和无水乙醇，在-20℃下放置过夜后，于4℃、13000 rpm的条件下离心20min，弃上清液，收集得到沉淀物并采用75%乙醇漂洗，再次进行离心并弃上清液，将所收集的沉淀物中的水分和残留乙醇去除后，采用ddh2o进行溶解，获得线性化重组人胶原蛋白质粒。
26、可选地，所述将所述线性化重组人胶原蛋白质粒电转化至毕赤酵母gs115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组人胶原蛋白酵母工程菌的步骤，包括：
27、将所述线性化重组人胶原蛋白质粒与毕赤酵母gs115感受态细胞混合，冰浴后，进行电击，再加入山梨醇溶液，混匀后，转移至无菌ep管中，经30°c静置孵育1h-2h后，涂布于含有zeocin的ypd平板上，室温静置10min，再经30℃倒置培养2d-5d，直至长出单菌落；
28、挑取所述ypd平板上的单菌落，转移至含有zeocin的ypd培养基的96孔培养板中，于30℃继续培养，以筛选获得重组人胶原蛋白酵母工程菌。
29、可选地，所述对所述重组脯氨酸羟化酶质粒进行酶切线性化，获得线性化重组脯氨酸羟化酶质粒的步骤，包括：
30、采用sacⅰ对所述重组脯氨酸羟化酶质粒进行酶切线性化处理，酶切温度为37℃，酶切时间为5h，再加入3m naac和无水乙醇，在-20℃下放置过夜后，在4℃、13000 rpm的条件下离心20min，弃上清液，收集得到沉淀物并采用75%乙醇漂洗，再次进行离心并弃上清液，将所收集的沉淀物中的水分和残留乙醇去除后，采用ddh2o进行溶解，获得线性化重组脯氨酸羟化酶质粒。
31、可选地，所述以所述重组人胶原蛋白酵母工程菌制备重组工程菌感受态细胞的步骤，包括：
32、将所述重组人胶原蛋白酵母工程菌平板划线后挑取单菌落接种于ypd固体培养基，在30℃、225rpm的条件下培养24h；再以1：1000的接种比例转接于ypd液体培养基，并在30℃、225 rpm的条件下培养至od600nm吸光值为1.3-1.5；再转入无菌离心管中，在4℃、1500rpm的条件下离心5min，弃上清后收集工程菌菌体；
33、用无菌超纯水重悬所述工程菌菌体，并在4℃、1500rpm的条件下离心5min，弃上清后，再用无菌超纯水重悬所述工程菌菌体，并在4℃、1500rpm的条件下离心5min，弃上清后，再用无菌1m山梨醇重悬细胞沉淀，再在4℃、1500 rpm的条件下离心5min，弃上清后，用无菌1m山梨醇重悬细胞沉淀，旋转混匀后，置于冰上，获得重组工程菌感受态细胞。
34、可选地，所述将所述线性化重组脯氨酸羟化酶质粒电转化至所述重组工程菌感受态细胞，经过培养和共表达阳性转化子筛选，获得重组人胶原蛋白共表达脯氨酸羟化酶酵母工程菌的步骤，包括：
35、将所述线性化重组脯氨酸羟化酶质粒与所述重组工程菌感受态细胞混合，冰浴后，进行电击，再加入山梨醇溶液，混匀后，转移至无菌ep管中，经30°c静置孵育1h-2h后，涂布于md固体平板，室温静置10min，再经30℃倒置培养2d-5d，直至长出单菌落；
36、刮下所述md固体平板上的his+转化子并进行稀释后，涂布于含有g418的ypd平板上，经30℃倒置培养至单菌落出现，再挑取所述ypd平板的单菌落转移至含ypd培养基的96孔培养板中，于30℃继续培养，筛选能够在含4mg/ml的g418的平板上生长的共表达阳性转化子，获得重组人胶原蛋白共表达脯氨酸羟化酶酵母工程菌。
37、可选地，所述对所述重组人胶原蛋白共表达脯氨酸羟化酶酵母工程菌进行诱导表达，离心收集发酵液上清的步骤，包括：
38、挑取在含4mg/ml的g418的平板上生长的单菌落接种于bmgy酵母生长培养基，在30℃、220rpm的条件下培养至od600nm吸光值为2-6，再于3000rpm的速率下离心10min，收集菌体并采用与所述bmgy酵母生长培养基等体积的bmmy酵母诱导培养基进行重悬，使起始od600nm吸光值为2，再在30℃、220rpm的条件下继续培养，每隔24h分别补加0.5%的甲醇、1%的微量元素和抗坏血酸，诱导后第72h分别取表达菌体沉淀、菌体沉淀破碎后上清和发酵液上清。
39、可选地，所述将所述发酵液上清纯化处理后，获得重组人源化胶原蛋白原液的步骤，包括：
40、采用阳离子交换介质，以磷酸盐缓冲液平衡层析柱至电导率值及a280吸光值不变，将所述发酵液上清上样，设置上样流速20cm/h，检测紫外a280吸光值；待上样结束后，再以磷酸盐缓冲液再平衡层析柱，直至电导和紫外a280 吸光值最低且不再变化，停止接样；再以含nacl 的磷酸盐缓冲液洗脱并收集对应的蛋白，得到重组人源化胶原蛋白原液。
41、本技术还提出了一种可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白的应用，将所述可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白应用于乳膏霜类化妆品中。
42、本技术以人源ⅰ型胶原蛋白融合ⅲ型胶原蛋白，并避开了基质金属蛋白酶所识别的主要酶切位点，获得野生型胶原蛋白肽，再采用计算机辅助蛋白质设计方法，通过结构模拟和能量计算，得到结合自由能更低、更有利于蛋白分子间交联的7种胶原蛋白肽突变体，以避免或降低重组人源化胶原蛋白在体内被蛋白酶水解，进而保证其在体内的长效性；再分别以野生型胶原蛋白肽和7种胶原蛋白肽突变体为基础单元重复串联4次后，获得8种重组人源化胶原蛋白，其基因序列如seq id no.19、seq id no.20、seq id no.21、seq idno.22、seq id no.23、seq id no.24、seq id no.25以及seq id no.26所示；再使用毕赤酵母真核表达系统共表达羟脯氨酸酶与重组人源化胶原蛋白，羟脯氨酸可进一步增强胶原蛋白分子间的交联和稳定性，从而成功获得了羟脯氨酸修饰的重组人源化胶原蛋白。该重组人源化胶原蛋白具有与天然胶原蛋白相似的低温自组装属性，不需要额外添加交联剂或凝胶赋形剂即可形成稳定的胶原蛋白凝胶，并避免了异源性过敏反应风险，且其具有较好的稳定性和生物学活性，不易被高温变性、降解，并具有良好的体外耐胶原酶酶解能力和体内长效性。
1.一种可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白，其特征在于，所述重组人源化胶原蛋白的基因序列如seq id no.19、seq id no.20、seq id no.21、seq idno.22、seq id no.23、seq id no.24、seq id no.25或seq id no.26所示。
2.一种如权利要求1所述的可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述基于人源ⅰ型胶原蛋白肽片段和人源ⅲ型胶原蛋白肽片段，设计不包含mmps主要酶切位点序列的重组人源化胶原蛋白氨基酸序列的步骤，包括：
4.根据权利要求3所述的可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述mmps主要酶切位点包括-gly-|-ile-、-pro-gln-gly-|-ile-ala-gly-gln-、-asn/asp-|-leu-gly-|-ile-asn-|-phe-gln-|-thr、-ala-|-gln-、-ala-|-leu-和-tyr-|-leu-。
5.根据权利要求4所述的可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述基于所述重组人源化胶原蛋白氨基酸序列，进行毕赤酵母密码子偏好性优化设计后，获得重组人源化胶原蛋白基因序列的步骤，包括：
6.根据权利要求5所述的可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述基于所述重组人源化胶原蛋白基因序列和毕赤酵母表达质粒pgapzαa，构建重组人源化胶原蛋白质粒的步骤，包括：
7.根据权利要求2所述的可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述以人源基因p4h作为脯氨酸羟化酶的氨基酸序列，根据毕赤酵母宿主密码子偏好性优化设计后，获得重组脯氨酸羟化酶的基因序列的步骤中，所述重组脯氨酸羟化酶的基因序列如seq id no.28所示。
8.根据权利要求7所述的可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述基于所述重组脯氨酸羟化酶的基因序列和毕赤酵母表达质粒ppic3.5k，构建重组脯氨酸羟化酶质粒的步骤，包括：
9.根据权利要求2所述的可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述对所述重组人源化胶原蛋白质粒进行酶切线性化，获得线性化重组人胶原蛋白质粒的步骤，包括：
10.根据权利要求2所述的可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述将所述线性化重组人胶原蛋白质粒电转化至毕赤酵母gs115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组人胶原蛋白酵母工程菌的步骤，包括：
11.根据权利要求2所述的可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述对所述重组脯氨酸羟化酶质粒进行酶切线性化，获得线性化重组脯氨酸羟化酶质粒的步骤，包括：
12.根据权利要求2所述的可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述以所述重组人胶原蛋白酵母工程菌制备重组工程菌感受态细胞的步骤，包括：
13.根据权利要求2所述的可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述将所述线性化重组脯氨酸羟化酶质粒电转化至所述重组工程菌感受态细胞，经过培养和共表达阳性转化子筛选，获得重组人胶原蛋白共表达脯氨酸羟化酶酵母工程菌的步骤，包括：
14.根据权利要求13所述的可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述对所述重组人胶原蛋白共表达脯氨酸羟化酶酵母工程菌进行诱导表达，离心收集发酵液上清的步骤，包括：
15.根据权利要求2所述的可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述将所述发酵液上清纯化处理后，获得重组人源化胶原蛋白原液的步骤，包括：
16.一种如权利要求1所述的可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白的应用，其特征在于，将所述可低温自组装且长效耐热稳定的重组人源化胶原蛋白应用于乳膏霜类化妆品中。
