一种基于g-c3n4纳米片的电化学发光传感器及检测病毒基因应用
技术领域：
1.本发明涉及一种基于g-c3n4纳米片与ru-sio2@fa共振能量转移的双波长比率型电化学发光生物传感器的制备方法，及其对sars-cov-2病毒的rdrp基因的超灵敏检测应用。
背景技术：2.电化学发光(ecl)是一种兼具了化学发光以及电化学二者优势的新型检测方法，与其他检测方法相比较，具有背景信号低、操作简便、程序可控以及检测速度快等优势[muzyka k.,saqib m.,liu z.,et al.biosens bioelectron.2017,92,241
–
258]。基于上述优点，ecl技术有助于实现对sars-cov-2病毒rdrp基因准确而灵敏的检测。比值型ecl检测以两个发射信号的比值与目标浓度建立线性关系，消除外在环境干扰，实现对目标物的高准确性检测[liu y.,wang m.,nie y.,et al.anal chem.2019,91,6250
–
6258]。双波长比率刑ecl检测是收集两个波长相关的发射极，通过共振能量转移(ecl-ret)的方式关联二者发光强度，避免了共反应物共用的限制，具有更好的应用前景[wang l.,liu p.,liu z.,et al.sensors and actuators b:chemical.2021,327]。
[0003]
石墨氮化碳纳米片(g-c3n4nss)作为一种新兴的二维非金属半导体材料，由于其在电极表面稳定性好、导电率高、生物相容性好、比表面积大等优点[volokh m.,peng g.,barrio j.,shalom m.angew.chem.int.ed.2019,58,6138
–
6151]，被广泛应用于生物传感领域[majdoub m.,anfar z.,amedlous a.acs nano.2020,14,12390
–
12469]。
[0004]
本发明设计了一种基于g-c3n4纳米片与ru-sio2@fa纳米材料之间共振能量转移的双波长比率型电化学发光生物传感器，实现了对sars-cov-2rdrp基因的超灵敏检测。
技术实现要素：[0005]
本发明的目的是提供一种基于g-c3n4纳米片与ru-sio2@fa纳米材料之间共振能量转移的双波长比率型电化学发光生物传感器的制备方法，以及利用该生物传感器实现对sars-cov-2rdrp基因的超灵敏检测应用。
[0006]
具体包括以下步骤：
[0007]
步骤1.g-c3n4纳米片的合成：5g三聚氰胺于马弗炉中550℃加热4h，得到的粉末研磨备用；1mg石墨氮化碳加入到100ml 5m的hno3中125℃回流24h，离心得固体粉末，60℃干燥过夜；
[0008]
步骤2.ru-sio2@fa的合成：340μl 0.1m的ru(bpy)3cl2·
6h2o、1.7ml tx-100、7.5ml环己烷、1.8ml正己醇混合，于25℃水浴锅搅拌30min，加入100μl teos和60μl nh3·
h2o室温反应24h；再加入10ml丙酮、乙醇与二次水多次洗涤；向ru-sio2加入200μl氨丙基三乙氧基硅烷aptes，于25℃黑暗中搅拌60min，洗涤，得nh
3-ru-sio2纳米微球；100μl 0.1m的edc与100μl 0.025m的nhs加入到200μl 0.1m的叶酸fa溶液中，于37℃孵育60min，15000rpm离心，得到的固体分散于200μl二次水中；最后将其与nh
3-ru-sio2纳米微球等体积混合，于
37℃孵育至少4h，12000rpm离心得ru-sio2@fa；
[0009]
步骤3.ru-sio2@fa-dna探针的合成：50μl 5μm生物条码dna与50μl 1μm探针dna t1混合，并向其中加入50μl 0.1m的edc与50μl 0.025m的nhs，震荡摇匀后于37℃孵育40min；离心，得ru-sio2@fa-dna探针；
[0010]
生物条码dna序列为：cooh-ttt gag tatagt ggc；
[0011]
t1序列为：cooh-ga tat cta cca tgaat；
[0012]
步骤4.三螺旋tsdna的合成：100μl10μm的ssdna-1与100μl10μm的ssdna-2，在tris-edta缓冲液中混合，然后将混合液于95℃退火5分钟，自然冷却至室温得dsdna结构；向dsdna溶液中加入200μl 5μm的ssdna-3，与200μl 10mm的mgcl2溶液，于4℃杂交12h以上，得三螺旋dna结构；
[0013]
ssdna-1序列为：aaaaaaaa ctct ctct ctct；
[0014]
ssdna-2序列为：agag agag agag aaaa aaaa；
[0015]
ssdna-3序列为：aatc tgt ccc tca tta agag agag agag aaaa aaaa；
[0016]
步骤5.双足3d dna步行器的构建：10μl 2μm的blocker 1与10μl 2μm的walker 1混合，于37℃孵育2h，得walker 1-blocker 1，同理得walker 2-blocker 2；4μl 1μm已活化羧基的walker 1-blocker 1、80μl 2μm的s2、2μl 2μm的a1与50μl sio2微球混合，于37℃孵育6h以上，离心，得到的沉淀物溶于100μl水中，得3d dna walker 1，同理得3d dna walker 2；100μl的3d dna walker 1跟2混合，于37℃孵育2h，得双足3d dna步行器；2μl不同浓度的target dna加入到100μl双足3d dna步行器中，于37℃孵育2h，然后向其中加入6u的nb.bbvci核酸内切酶，于37℃孵育80min，离心，收集含outputdna链的上清液备用；
[0017]
blocker 1序列为：tgaggg cat ctc ctgatg agg ttc cac ctg，
[0018]
walker 1序列为：cooh-(t)
27
ttc agg aga tgc cct cag cct tc，
[0019]
walker 2序列为：cooh-(t)
27
gtc agg aga tgc cct cag cct tc
[0020]
blocker 2序列为：cta ggg cat ctc ctg atg agg ttc cac ctg
[0021]
s2序列为：cooh-ttt agt cta gga agg ctg agg gac aga ttg gat tca tgg tag at
[0022]
a1序列为：cooh-act gct agc atc gat
[0023]
a2序列为：cooh-atc gat gct agc agt
[0024]
s1序列为：cooh-ttt tca act gga agg ctg agg gac aga ttg gat tca tgg tag at
[0025]
target dna序列为：cag gtg gaa cct cat cag gag atg c
[0026]
步骤6.ecl生物传感器的构建：10μl 1mg/ml的g-c3n4纳米片滴加到金电极表面并自然晾干，取5μl tsdna滴加到g-c3n4纳米片/ge表面于4℃孵育1.5h，润洗；10μl含output dna链的上清液与10μl ru-sio2@fa-dna探针滴加到电极表面并孵育，润洗，得ecl生物传感器于4℃保存备用；
[0027]
步骤7.ecl检测：利用mpi-e电化学发光仪器，在含0.1m kcl和0.05m k2s2o
82-或0.1m三丙胺的0.1mph 7.4pbs中检测，扫描速度为100mv/s，两个波长460nm和620nm处的ecl信号通过特殊的光学滤波片得到，该滤波片只能发出对应波长的信号；620nm扫描范围为0v～1.5v，460nm的扫描范围为-1.5v～0v，光电倍增管电压为700v。
[0028]
本发明与现有技术相比，主要优点在于：本发明利用新颖的g-c3n4nss纳米片与ru-sio2@fa作为双波长ecl信号探针，具有极强的电化学发光信号，通过高效ecl能量转移构建了比率型ecl传感器，极大提高了检测灵敏度和准确性；本发明还利用双足3d dna步行器作为信号放大器，将痕量的目标基因转化为大量的次级目标，实现了对sars-cov-2rdrp基因的超灵敏检测；同时利用三螺旋dna捕捉探针，稳定垂直地固定在电极表面，极大提高了dna结合效率和传感器的检测灵敏度。本发明的电化学发光生物传感器具有良好的背景信号、操作简便、程序可控以及检测速度快，在早期临床诊断和生物医学分析检测中展现出巨大的应用潜力，可以用于实际样品的检测。
附图说明：
[0029]
图1.电化学发光传感器原理示意图：基于g-c3n4纳米片的双波长比率型电化学发光生物传感器检测sars-cov-2rdrp基因
[0030]
图2.dna步行器电泳表征：链置换过程(a)：泳道1：target dna；泳道2：blocker dna；泳道3：walker dna；泳道4：walker+blocker dna；泳道5：target+blocker dna；泳道6：walker+blocker dna双链中加入target dna；泳道m：marker dna。循环扩增过程(b)：泳道1：walker dna；泳道2：s1 dna；泳道3：ssdna-3；泳道4：t1 dna；泳道5：walker+s1；泳道6：walker+s1+nb.bbvci；泳道7：walker+s1+nb.bbvci+ssdna-3；泳道8：walker+s1+nb.bbvci+t1；泳道9：walker+s1+nb.bbvci+ssdna-3+t1；泳道m：marker dna。
[0031]
dna步行器硅球连接及三螺旋dna构建过程(c)：泳道1：a1 dna,泳道2:a2 dna,泳道3:a1+a2；泳道4:ssdna-1,泳道5:ssdna-2,泳道6:ssdna-3,泳道7:ssdna-1+ssdna-2,泳道8:ssdna-1+ssdna-2duplex+ssdna-3+mgcl2,泳道m:marker dna.
[0032]
图3.(a)氨基化sio2微球的sem图像；(b)ru-sio2微球的sem图像；(c)ru-sio2微球的tem图像；(d)ru-sio2@fa-probe dna生物偶联物探针的tem图像。
[0033]
图4.不同浓度rdrp基因对应的(a)g-c3n4nss和(b)ru-sio
2 ecl强度-时间曲线；(c)g-c3n4nss在460nm波长处和ru-sio2在620nm波长处的ecl响应信号与rdrp基因浓度(10-6
～10nm)之间的线性关系；(d)lg(i
1(620nm)
/i
2(460nm)
)对目标rdrp基因浓度检测的校准曲线。
[0034]
图5.ecl生物传感器检测不同dna的特异性：(a)空白溶液，(b)1nm sars-cov rdrp基因，(c)1nm错配dna，(d)1nm随机dna，(e)混合dna(包括1nm sars-cov rdrp基因，1pm新型冠状病毒rdrp基因，1nm随机dna和1nm错配dna)，(f)1pm sars-cov-2rdrp基因。
具体实施方式：
[0035]
实施例1.电化学发光传感器的制备及对sars-cov-2rdrp基因的检测。
[0036]
步骤1.ru-sio2@fa-dna探针的合成：50μl 5μm生物条码dna与50μl 1μm探针dnat1混合，并向其中加入50μl 0.1m的edc与50μl 0.025m的nhs，震荡摇匀后于37℃孵育40min；离心，得ru-sio2@fa-dna探针；
[0037]
步骤4.三螺旋dna(tsdna)的合成：100μl 10μm的ssdna-1与100μl 10μm的ssdna-2混合，于95℃退火5分钟，自然冷却至室温得dsdna结构；加入200μl 5μm的ssdna-3与200μl 10mm的mgcl2溶液，于4℃杂交12h，得三螺旋dna；
[0038]
步骤5.双足3d dna步行器的构建：10μl 2μm的blocker 1与10μl 2μm的walker 1
混合,于37℃孵育2h，得walker 1-blocker 1，同理得walker 2-blocker 2；4μl 1μm walker 1-blocker 1、80μl 2μm的s2、2μl 2μm的a1与50μl sio2微球混合，于37℃孵育6h，离心，得到沉淀物溶于100μl水中，得3d dna walker 1，同理得3d dna walker 2；100μl的3d dna walker 1跟2混合，于37℃孵育2h，得3d dna步行器；2μl不同浓度的target dna加到100μl 3d dna步行器中，于37℃孵育2h，然后加入6u的核酸内切酶，于37℃孵育80min，离心，收集outputdna溶液；
[0039]
步骤6.ecl生物传感器构建：10μl 1mg/ml的g-c3n4nss滴加到金电极表面并自然晾干，取5μl tsdna滴加到g-c3n4nss/ge表面于4℃孵育1.5h，润洗；10μl含output dna的上清液与10μl ru-sio2@fa-dna探针滴加到电极表面并孵育，润洗，得ecl生物传感器于4℃保存备用。
[0040]
步骤7.ecl检测：利用mpi-e电化学发光仪器，在含0.1m kcl和0.05m k2s2o
82-或0.1m三丙胺的pbs(0.1m,ph 7.4)中检测，扫描速度为100mv/s，扫描范围为0v～1.5v(620nm)或-1.5v～0v(460nm)，光电倍增管(pmt)电压为700v。两个波长460nm和620nm处的ecl信号通过特殊的光学滤波片得到，该滤波片只能发出对应波长的信号。
[0041]
实施例2.电化学发光传感器的制备及对sars-cov-2rdrp基因的检测。
[0042]
将“10μl 2μm的blocker 1与10μl 2μm的walker 1混合,于37℃孵育2h”改为“10μl 2μm的blocker 1与10μl 2μm的walker 1混合,于37℃孵育3h”，制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的生物传感器。对sars-cov-2rdrp基因的检测结果同实施例1。
[0043]
实施例3.电化学发光传感器的制备及对sars-cov-2rdrp基因的检测。
[0044]
将“4μl 1μm已活化羧基的walker 1-blocker 1、80μl 2μm的s2、2μl 2μm的a1与50μl sio2微球混合，于37℃孵育6h以上”改为“4μl 1μm已活化羧基的walker 1-blocker 1、80μl 2μm的s2、2μl 2μm的a1与50μl sio2微球混合，于37℃孵育过夜”，制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的生物传感器。对sars-cov-2rdrp基因的检测结果同实施例1。
[0045]
实施例4.电化学发光传感器的制备及对sars-cov-2rdrp基因的检测。
[0046]
将“然后向其中加入6u的nb.bbvci核酸内切酶，于37℃孵育80min”改为“然后向其中加入7u的nb.bbvci核酸内切酶，于37℃孵育80min”，制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的生物传感，对sars-cov-2rdrp基因的检测结果同实施例1。
[0047]
实施例5.电化学发光传感器的制备及对sars-cov-2rdrp基因的检测。
[0048]
将“取5μl tsdna滴加到g-c3n4nss/ge表面于4℃孵育1.5h”改为“取5μl tsdna滴加到g-c3n4nss/ge表面于4℃孵育2h”，制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的生物传感器，对sars-cov-2rdrp基因的检测结果同实施例1。
技术特征：1.一种基于g-c3n4纳米片的电化学发光传感器在sars-cov-2 rdrp基因检测中的应用，其特征是：利用g-c3n4nss纳米片与ru-sio2@fa作为双波长ecl信号探针，通过g-c3n4纳米片与ru-sio2@fa纳米材料之间高效的ecl能量转移，利用双足3d dna步行器放大技术将痕量目标转化为大量的次级目标，构建了比率型ecl传感器，实现了对目标sars-cov-2 rdrp基因的高灵敏检测；具体如下：步骤1.g-c3n4纳米片的合成：5g三聚氰胺于马弗炉中550℃加热4h，得到的粉末研磨备用；1mg石墨氮化碳加入到100ml 5m的hno3中125℃回流24h，离心得固体粉末，60℃干燥过夜；步骤2.ru-sio2@fa的合成：340μl 0.1m的ru(bpy)3cl2·
6h2o、1.7ml tx-100、7.5ml环己烷、1.8ml正己醇混合，于25℃水浴锅搅拌30min，加入100μl teos和60μl nh3·
h2o室温反应24h；再加入10ml丙酮、乙醇与二次水多次洗涤；向ru-sio2加入200μl氨丙基三乙氧基硅烷aptes，于25℃黑暗中搅拌60min，洗涤，得nh
3-ru-sio2纳米微球；100μl 0.1m的edc与100μl 0.025m的nhs加入到200μl 0.1m的叶酸fa溶液中，于37℃孵育60min，15000rpm离心，得到的固体分散于200μl二次水中；最后将其与nh
3-ru-sio2纳米微球等体积混合，于37℃孵育至少4h，12000rpm离心得ru-sio2@fa；步骤3.ru-sio2@fa-dna探针的合成：50μl 5μm生物条码dna与50μl 1μm探针dna t1混合，并向其中加入50μl 0.1m的edc与50μl 0.025m的nhs，震荡摇匀后于37℃孵育40min；离心，得ru-sio2@fa-dna探针；生物条码dna序列为：cooh-ttt gag tat agt ggc；t1序列为：cooh-ga tat cta cca tgaat；步骤4.三螺旋tsdna的合成：100μl10μm的ssdna-1与100μl10μm的ssdna-2，在tris-edta缓冲液中混合，然后将混合液于95℃退火5分钟，自然冷却至室温得dsdna结构；向dsdna溶液中加入200μl 5μm的ssdna-3，与200μl 10mm的mgcl2溶液，于4℃杂交12h以上，得三螺旋dna结构；ssdna-1序列为：aaaa aaaa ctct ctct ctct；ssdna-2序列为：agag agag agag aaaa aaaa；ssdna-3序列为：aatc tgt ccc tca tta agag agag agag aaaa aaaa；步骤5.双足3d dna步行器的构建：10μl 2μm的blocker 1与10μl 2μm的walker 1混合，于37℃孵育2h，得walker 1-blocker 1，同理得walker 2-blocker 2；4μl 1μm已活化羧基的walker 1-blocker 1、80μl 2μm的s2、2μl 2μm的a1与50μl sio2微球混合，于37℃孵育6h以上，离心，得到的沉淀物溶于100μl水中，得3d dna walker 1，同理得3d dna walker 2；100μl的3d dna walker 1跟2混合，于37℃孵育2h，得双足3d dna步行器；2μl不同浓度的target dna加入到100μl双足3d dna步行器中，于37℃孵育2h，然后向其中加入6u的nb.bbvci核酸内切酶，于37℃孵育80min，离心，收集含outputdna链的上清液备用；blocker 1序列为：tgagggcatctcctgatg agg ttc cac ctg，walker 1序列为：cooh-(t)
27
ttcaggagatgccct cag cct tc，walker 2序列为：cooh-(t)
27
gtcaggagatgccct cag cct tcblocker 2序列为：ctagggcatctcctgatg agg ttc cac ctg
s2序列为：cooh-ttt agt cta gga agg ctg agg gac aga ttg gat tca tgg tag ata1序列为：cooh-act gct agc atc gata2序列为：cooh-atc gat gct agc agts1序列为：cooh-ttt tca act gga agg ctg agg gac aga ttg gat tca tgg tag attarget dna序列为：cag gtg gaa cct cat cag gag atg c步骤6.ecl生物传感器的构建：10μl 1mg/ml的g-c3n4纳米片滴加到金电极表面并自然晾干，取5μl tsdna滴加到g-c3n4纳米片/ge表面于4℃孵育1.5h，润洗；10μl含output dna链的上清液与10μl ru-sio2@fa-dna探针滴加到电极表面并孵育，润洗，得ecl生物传感器于4℃保存备用；步骤7.ecl检测：利用mpi-e电化学发光仪器，在含0.1m kcl和0.05m k2s2o
82-或0.1m三丙胺的0.1m ph 7.4pbs中检测，扫描速度为100mv/s，两个波长460nm和620nm处的ecl信号通过特殊的光学滤波片得到，该滤波片只能发出对应波长的信号；620nm扫描范围为0v～1.5v，460nm的扫描范围为-1.5v～0v，光电倍增管电压为700v。
技术总结本发明公开了一种基于g-C3N4纳米片和Ru-SiO2@FA的比率型电化学发光生物传感器的制备以及在SARS-CoV-2RdRp基因检测中的应用。本发明的技术方案是利用g-C3N4纳米片和Ru-SiO2@FA作为双波长ECL信号探针，利用三螺旋DNA捕捉探针，稳定垂直地固定在电极表面，极大提高了捕捉DNA结合效率和传感器的检测灵敏度；以双足3D DNA步行器作为信号放大器，将痕量的目标基因转化为大量的次级目标，利用次级目标将Ru-SiO2@FA淬灭探针连接到电极表面，通过g-C3N4和Ru-SiO2@FA双波长的ECL共振能量转移，构建ECL生物传感器，实现SARS-CoV-2RdRp基因的超灵敏检测。该研究思路为实现SARS-CoV-2RdRp基因的分析检测提供了新的技术方法和策略。分析检测提供了新的技术方法和策略。
技术研发人员：接贵芬 王冰 尹腾跃
受保护的技术使用者：青岛科技大学
技术研发日：2022.07.26
技术公布日：2022/11/1
