背景技术：
1、多核苷酸和蛋白质的递送对于广泛的治疗领域是重要的。然而，目前的递送方式往往无效。例如，递送短多肽(如编码抗融合多肽的多肽)通常导致所述多肽的短半衰期和快速清除。因此，需要改进的用于递送抗融合多肽的组合物和方法，例如，用于治疗或预防病毒感染。
技术实现思路
1、本披露提供了用于产生、纯化和使用编码抗融合多肽的环状rna的组合物和方法。
2、在一方面，本发明的特征在于环状多核糖核苷酸，其包括编码抗融合多肽的多核糖核苷酸货物(polyribonucleotide cargo)。在一些实施例中，多核糖核苷酸货物包括编码抗融合多肽的表达序列。
3、在一些实施例中，多核糖核苷酸货物包括编码表1的多肽的表达序列。在一些实施例中，多核糖核苷酸货物包括编码与表1的多肽具有至少85％(例如，至少90％、95％、97％、99％或100％)序列同一性的多肽的表达序列。在一些实施例中，多核糖核苷酸货物包括编码与seq id no:1-324中任一个具有至少85％(例如，至少90％、95％、97％、99％或100％)序列同一性的多肽的表达序列。
4、在一些实施例中，所述环状多核糖核苷酸包含连接5'外显子片段和3'外显子片段的剪接点。
5、在一些实施例中，多核糖核苷酸货物包括与编码抗融合多肽的表达序列可操作地连接的ires。所述环状多核糖核苷酸可进一步包含所述ires与所述3'外显子片段或所述5'外显子片段之间的间隔子区域。所述间隔子区域的长度可以为至少5个核糖核苷酸。例如，间隔子区域的长度可以为至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000个或更多个核糖核苷酸。在一些实施例中，间隔子区域的长度为5至500个核糖核苷酸。所述间隔子区域可以包括聚a、聚a-c、聚a-u或聚a-g序列。间隔子区域可以是随机序列。
6、在一些实施例中，所述环状多核糖核苷酸的长度为至少500个核糖核苷酸。例如，环状多核糖核苷酸可以是至少500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000个或更多个核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的长度为500至20,000个核糖核苷酸。
7、在另一方面，特征在于线性多核糖核苷酸，所述线性多核糖核苷酸从5'到3'包括(a)3'内含子片段；(b)3'剪接位点；(c)3'外显子片段；(d)编码所述抗融合多肽的多核糖核苷酸货物；(e)5'外显子片段；(f)5'剪接位点；和(g)5'内含子片段。
8、在一些实施例中，多核糖核苷酸货物包括编码抗融合多肽的表达序列。
9、在一些实施例中，多核糖核苷酸货物包括与编码抗融合多肽(例如，表1的多肽)的表达序列可操作地连接的ires。所述环状多核糖核苷酸可进一步包含所述ires与所述3'外显子片段或所述5'外显子片段之间的间隔子区域。所述环状多核糖核苷酸可进一步包括(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)中一个或多个之间的间隔子区域。
10、所述间隔子区域的长度可以为至少5个核糖核苷酸。例如，间隔子区域的长度可以为至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个或更多个核糖核苷酸。在一些实施例中，间隔子区域的长度为5至500个核糖核苷酸。所述间隔子区域可以包括聚a、聚a-c、聚a-u或聚a-g序列。间隔子区域可以是随机序列。
11、在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少ires。在一些实施例中，所述环状多核糖核苷酸缺少5'帽和聚a序列中的一者或两者。
12、在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含蛋白质翻译起始位点。在一些实施例中，蛋白质翻译起始位点包含科扎克(kozak)序列。
13、在一些实施例中，所述线性多核糖核苷酸的长度为至少500个核糖核苷酸。例如，线性多核糖核苷酸可以是至少500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000个或更多个核糖核苷酸。在一些实施例中，所述线性多核糖核苷酸的长度为500至20,000个核糖核苷酸。
14、在另一方面，特征在于编码如本文所述的多核糖核苷酸(例如，线性或环状多核糖核苷酸)的dna载体。
15、在另一方面，特征在于在细胞中表达抗融合多肽(例如，表1的多肽)的方法。所述方法包括在适于表达抗融合多肽的条件下向细胞提供如本文所述的环状、线性多核糖核苷酸或dna载体。
16、在另一方面，特征在于由如本文所述的线性多核糖核苷酸产生环状多核糖核苷酸的方法。所述方法包括在适于所述线性多核糖核苷酸自剪接以产生所述环状多核糖核苷酸的条件下提供所述线性多核糖核苷酸。
17、在另一方面，特征在于一种药物组合物，所述药物组合物包含上述实施例中任一个的环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸或dna载体，以及稀释剂、载剂或赋形剂。
18、在另一方面，特征在于在受试者中表达抗融合多肽(例如，表1的多肽)的方法。所述方法包括以足以在受试者中产生至少500ng/ml(例如，至少600ng/ml、700ng/ml、800ng/ml、900ng/ml、1,000ng/ml、1,100ng/ml、1,200ng/ml、1,300ng/ml、1,400ng/ml、1,500ng/ml、1,600ng/ml、1,700ng/ml、1,800ng/ml、1,900ng/ml、2,000ng/ml、2,100ng/ml、2,200ng/ml、2,300ng/ml、2,400ng/ml、2,500ng/ml、2,600ng/ml、2,700ng/ml、2,800ng/ml、2,900ng/ml、3,000ng/ml或更多)的血清浓度的抗融合多肽(例如，表1的多肽)的量施用第一剂量的药物组合物。
19、在一些实施例中，所述方法可进一步包括施用第二剂量的药物组合物。所述方法可进一步包括施用第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多剂量的药物组合物。
20、在一些实施例中，第二剂量在药物组合物的第一剂量后至少一小时(例如，至少两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、七小时、八小时、九小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、十个月、十一个月、一年或更长时间)施用。
21、在一些实施例中，第二剂量在药物组合物的第一剂量后1小时至1年(例如1小时到1天，例如一小时、两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、七小时、八小时、九小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或一天，例如一天到一周，例如两天、三天、四天、五天、六天或一周，例如一周到一个月，例如两周、三周或一个月，例如一个月到一年，例如一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月或一年)施用。在一些实施例中，第二剂量在药物组合物的第一剂量后1天至180天(例如，1天到90天、1天到45天、1天到30天、1天到14天、1天到7天、2天到45天、2天到30天、2天到14天、2天到7天、3天到90天、3天到45天、3天到30天、3天到14天、3天到7天、4天到90天、4天到45天、4天到30天、4天到14天、4天到7天、5天到90天、5天到45天、5天到30天、5天到14天、5天到7天、6天到90天、6天到45天、6天到30天、6天到14天、6天到7天、7天到90天、7天到45天、7天到30天、7天到14天、14天到90天、14天到45天、14天到30天、21天到90天、21天到60天、21天到45天、21天到30天、30天到90天、30天到60天、30天到45天、45天到180天、45天到120天、45天到100天、45天到90天、45天到60天、60天到180天、60天到120天、60天到100天、60天到90天、90天到100天、90天到120天或90天至180天)施用。
22、在一些实施例中，第三剂量在药物组合物的第二剂量后至少一小时(例如，至少两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、七小时、八小时、九小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、十个月、十一个月、一年或更长时间)施用。
23、在一些实施例中，第三剂量在药物组合物的第二剂量后1小时至1年(例如1小时到1天，例如一小时、两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、七小时、八小时、九小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或一天，例如一天到一周，例如两天、三天、四天、五天、六天或一周，例如一周到一个月，例如两周、三周或一个月，例如一个月到一年，例如一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月或一年)施用。在一些实施例中，第三剂量在药物组合物的第二剂量后1天至180天(例如，1天到90天、1天到45天、1天到30天、1天到14天、1天到7天、2天到45天、2天到30天、2天到14天、2天到7天、3天到90天、3天到45天、3天到30天、3天到14天、3天到7天、4天到90天、4天到45天、4天到30天、4天到14天、4天到7天、5天到90天、5天到45天、5天到30天、5天到14天、5天到7天、6天到90天、6天到45天、6天到30天、6天到14天、6天到7天、7天到90天、7天到45天、7天到30天、7天到14天、14天到90天、14天到45天、14天到30天、21天到90天、21天到60天、21天到45天、21天到30天、30天到90天、30天到60天、30天到45天、45天到180天、45天到120天、45天到100天、45天到90天、45天到60天、60天到180天、60天到120天、60天到100天、60天到90天、90天到100天、90天到120天或90天至180天)施用。
24、在一些实施例中，在所述受试者的血清中所述抗融合多肽的血清浓度小于约500ng/ml之前施用所述第二剂量。
25、在一些实施例中，所述方法在所述受试者中维持至少500ng/ml(例如，至少600ng/ml、700ng/ml、800ng/ml、900ng/ml、1,000ng/ml、1,100ng/ml、1,200ng/ml、1,300ng/ml、1,400ng/ml、1,500ng/ml、1,600ng/ml、1,700ng/ml、1,800ng/ml、1,900ng/ml、2,000ng/ml、2,100ng/ml、2,200ng/ml、2,300ng/ml、2,400ng/ml、2,500ng/ml、2,600ng/ml、2,700ng/ml、2,800ng/ml、2,900ng/ml、3,000ng/ml或更多)的血清浓度的抗融合多肽，例如持续至少一小时(例如，至少两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、七小时、八小时、九小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、十个月、十一个月、一年或更长时间)。
26、在一些实施例中，所述方法治疗或预防所述受试者中的病毒感染。例如，所述药物组合物可以足以治疗或预防病毒感染的量和持续时间施用给所述受试者。可以将药物组合物施用给受试者以降低病毒感染的风险。
27、在一些实施例中，所述方法治疗或预防人免疫缺陷病毒(hiv)感染。
28、在一些实施例中，所述方法治疗或预防冠状病毒感染(例如乙型冠状病毒(betacoronavirus)感染，例如sars-cov-2感染，如产生covid-19症状的sars-cov-2感染)。
29、在一些实施例中，所述方法治疗或预防丙型肝炎病毒(hcv)感染。
30、在一些实施例中，编码抗融合多肽(例如，表1的多肽)的环状多核苷酸用于减少病毒进入。
31、在另一方面，特征在于环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含编码多个抗融合多肽的多核糖核苷酸货物。所述多核糖核苷酸货物可以包含编码抗融合多肽的表达序列。在一些实施例中，所述抗融合多肽针对相同的病毒。可替代地，所述抗融合多肽可以针对多于一种病毒。
32、定义
33、为了促进对本披露的理解，下面定义了多个术语。本文定义的术语具有如与本披露相关的领域中的普通技术人员通常理解的含义。术语如“一个/种(a、an)”和“所述”并不旨在仅指单个实体，而是包括可以使用特定实例来说明的一般类别。术语“或”用于意指“和/或”，除非明确指出仅指替代物或者替代物相互排斥，尽管本披露支持仅指替代物和“和/或”的定义。本文的术语用于描述特定实施例，但它们的使用不应被视为限制，除非在权利要求中列出。
34、如本文所用，在值的范围内提供的任何值都包括上限和下限、以及所述上限和下限内含有的任何值。
35、如本文所用，术语“约”是指列举值的±10％内的值。
36、如本文所用，术语“载剂”是通过对环状多核糖核苷酸的共价修饰、经由部分或完全包封剂或者它们的组合促进组合物(例如，环状多核糖核苷酸)转运或递送到细胞中的化合物、组合物、试剂或分子。载剂的非限制性实例包括碳水化合物载剂(例如，酸酐改性的植物糖原或糖原型材料)、纳米颗粒(例如，包封或共价连接/结合到环状多核糖核苷酸的纳米颗粒)、脂质体、融合体、离体分化的网织红细胞、外泌体、蛋白质载剂(例如，共价连接到环状多核糖核苷酸的蛋白质)或阳离子载剂(例如，阳离子脂质聚合物或转染试剂)。
37、如本文所用，术语“环状多核糖核苷酸”、“环状rna”和“circrna”可互换使用，并且意指具有无游离端(即，无游离3'或5'端)的结构的多核糖核苷酸分子，例如通过共价或非共价键形成环状或无端结构的多核糖核苷酸分子。环状多核糖核苷酸可以是例如共价闭合的多核糖核苷酸。
38、如本文所用，术语“环化效率”是所得环状多核糖核苷酸相对于其非环状起始材料的测量。
39、术语“稀释剂”意指包含非活性溶剂的媒介物，本文所述的组合物(例如，包含环状多核糖核苷酸的组合物)可以稀释或溶解在其中。稀释剂可以是rna增溶剂、缓冲液、等渗剂或其混合物。稀释剂可以是液体稀释剂或固体稀释剂。液体稀释剂的非限制性实例包括水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂(诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯以及1,3-丁二醇。固体稀释剂的非限制性实例包括碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉或糖粉。
40、如本文所用，术语“疾病”、“病症”和“病状”各自指亚健康状态，例如，通常被或将会被医疗专业人员诊断或治疗的状态。
41、如本文所用，术语“表达序列”是编码产物例如肽或多肽(例如抗融合多肽)的核酸序列。编码肽或多肽的示例性表达序列可以包括多个核苷酸三联体，其中每一个都可以编码氨基酸，并被称为“密码子”。
42、如本文所用，关于多肽或核酸序列(例如，抗融合多肽或编码抗融合多肽的核酸序列)的术语“片段”是指多肽或核酸序列的连续的、少于全部的部分。例如，多肽或编码多肽的核酸序列的片段，是指序列(如本文披露的序列)的连续的、少于全部的部分(例如，整个长度的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)。应理解，本披露的所有内容考虑了本文披露的任何抗融合多肽的片段。
43、如本文所用，术语“fc结构域”是指包括至少铰链结构域以及第二和第三抗体恒定结构域(ch2和ch3)或其功能片段(例如，能够二聚化和结合fc受体的片段)的多肽链。fc结构域可以是任何免疫球蛋白抗体同种型，包括igg、ige、igm、iga或igd(例如igg)。另外，fc结构域可以是igg亚型(例如igg1、igg2a、igg2b、igg3或igg4)(例如igg1)。fc结构域不包括免疫球蛋白中可作为抗原识别区的任何部分，例如可变结构域或互补决定区(cdr)。如本文所述的缀合物中的fc结构域可以包含野生型fc结构域序列中的改变fc结构域和fc受体之间相互作用的一个或多个变化(例如，1-10、1-8、1-6、1-4个氨基酸取代、添加或缺失)。适合的变化的实例在本领域是已知的。除非本文另有说明，否则igg或fc结构域中氨基酸残基的编号是根据抗体的eu编号系统，也称为kabat eu索引，如例如kabat等人，sequences ofproteins of immunological interest[具有免疫学意义的蛋白质序列]，第5版公共卫生服务，国家卫生研究所，贝塞斯达，马里兰州,1991中所述
44、如本文所用，术语“gc含量”是指核酸序列中鸟嘌呤(g)和胞嘧啶(c)的百分比。用于计算gc含量的公式为(g+c)/(a+g+c+u)×100％(对于rna)或(g+c)/(a+g+c+t)×100％(对于dna)。同样地，术语“尿苷含量”是指核酸序列中尿苷(u)的百分比。用于计算尿苷含量的公式为u/(a+g+c+u)×100％。同样地，术语“胸苷含量”是指核酸序列中胸苷(t)的百分比。用于计算胸苷含量的公式为t/(a+g+c+t)×100％。
45、“异源”意指发生在与天然存在的(天然的)背景不同的背景中。“异源”多核苷酸序列指示多核苷酸序列以在所述序列的天然基因组中发现的方式不同的方式使用。例如，“异源启动子”用于驱动序列的转录，所述序列不是由所述启动子天然转录的序列；因此，“异源启动子”序列通常通过重组核酸技术包括在表达构建体中。术语“异源”也用于指被置于与另一序列的非天然存在的关系中的给定序列；例如，异源编码或非编码核苷酸序列通常通过基因组转化技术被插入基因组中，产生经基因修饰的基因组或重组基因组。
46、如本文所用，术语“内含子片段”是指内含子的部分，其中第一内含子片段和第二内含子片段一起形成内含子，如催化内含子。内含子片段可以是内含子的5'部分(例如，催化内含子的5'部分)或内含子的3'部分(例如，催化内含子的3'部分)，这样5'内含子片段和3'内含子片段一起形成功能性内含子，如能够催化自剪接的功能性内含子。术语内含子片段意指内含子分成两个部分。术语内含子片段并非意在指出、暗示或表明这两个部分或两半长度相等。术语内含子片段与术语断裂内含子同义使用，并且可以代替术语“半内含子”使用。
47、如本文所用，术语“线性对应物”是具有与环状多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或之间的任何百分比的序列同一性)并且具有两个游离端(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))的多核糖核苷酸分子(及其片段)。在一些实施例中，线性对应物(例如，环化前形式)是与环状多核糖核苷酸具有相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或其间的任何百分比序列同一性)并且具有相同或相似的核酸修饰的多核糖核苷酸分子(及其片段)并且具有两个游离端(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))。在一些实施例中，线性对应物是具有与环状多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或之间的任何百分比的序列同一性)和不同的核酸修饰或没有核酸修饰并且具有两个游离端(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))的多核糖核苷酸分子(及其片段)。在一些实施例中，作为线性对应物的多核糖核苷酸分子的片段是线性对应物多核糖核苷酸分子的比所述线性对应物多核糖核苷酸分子短的任何部分。在一些实施例中，线性对应物进一步包括5'帽。在一些实施例中，线性对应物进一步包括聚腺苷尾。在一些实施例中，线性对应物进一步包括3'utr。在一些实施例中，线性对应物进一步包括5'utr。
48、如本文所用，术语“线性rna”、“线性多核糖核苷酸”和“线性多核糖核苷酸分子”可互换使用并且意指具有5'端和3'端的多核糖核苷酸分子。5'端和3'端中的一个或两个可以是游离端或者可以与另一部分连接。线性rna包括尚未经历环化(例如，环化前)的rna，并且可以用作起始材料通过例如夹板连接或化学、酶促、核酶或剪接催化的环化方法进行环化。
49、如本文所用，术语“经修饰的核糖核苷酸”意指具有至少一个针对糖、核碱基或核苷间键的修饰的核苷酸。
50、如本文所用，术语“裸递送”是用于递送到细胞而无需载剂的帮助且无需对有助于递送到细胞的部分的共价修饰的配制品。裸递送配制品不含任何转染试剂、阳离子载剂、碳水化合物载剂、纳米颗粒载剂或蛋白质载剂。例如，环状多核糖核苷酸的裸递送配制品是包括没有共价修饰的环状多核糖核苷酸并且不含载剂的配制品。
51、如本文所用，术语“带切口的rna”和“带切口的线性多核糖核苷酸”和“带切口的线性多核糖核苷酸分子”可以互换使用并且意指由于环状rna切口或降解而产生的具有5'端和3'端的多核糖核苷酸分子。
52、术语“药物组合物”旨在同样披露包括在药物组合物中的环状或线性多核糖核苷酸可用于通过疗法治疗人体或动物体。因此，这意味着等同于“用于在疗法中使用的多核糖核苷酸”。
53、如本文所用，术语“多核苷酸”意指包括一个或多个核酸亚基或核苷酸的分子，并且可以与“核酸”或“寡核苷酸”互换使用。多核苷酸可以包括一个或多个选自腺苷(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)或其变体的核苷酸。核苷酸可以包括核苷和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个磷酸(po3)基团。核苷酸可以包括核碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)以及一个或多个磷酸基团。核糖核苷酸是其中糖为核糖的核苷酸。多核糖核苷酸或核糖核酸或rna可以指包括经由磷酸二酯键聚合的多个核糖核苷酸的大分子。脱氧核糖核苷酸是其中糖是脱氧核糖的核苷酸。如本文所用，叙述胸腺嘧啶(t)的多核糖核苷酸序列应被理解为表示尿嘧啶(u)。
54、如本文所用，本文的术语“多核糖核苷酸货物”包括包含至少一个多核糖核苷酸的任何序列。在实施例中，多核糖核苷酸货物包括一个或多个表达序列，其中每个表达序列编码多肽。在实施例中，多核糖核苷酸货物包括一个或多个非编码序列，如具有调控或催化功能的多核糖核苷酸。在实施例中，多核糖核苷酸货物包括表达序列和非编码序列的组合。在实施例中，多核糖核苷酸货物包括本文所述的一个或多个多核糖核苷酸序列，诸如一个或多个调控元件、内部核糖体进入位点(ires)元件或间隔子序列。
55、如本文中可互换使用的，术语“聚a”和“聚a序列”是指至少5个核苷酸长并由腺苷残基组成的核酸分子的非翻译连续区域。在一些实施例中，聚a序列的长度为至少10个、至少15个、至少20个、至少30个、至少40个或至少50个核苷酸。在一些实施例中，聚a序列位于开放阅读框(例如编码多肽的开放阅读框)的3'(例如下游)，并且聚a序列位于终止元件(例如终止密码子)的3'，使得聚a不被翻译。在一些实施例中，聚a序列位于终止元件的3'并且是3'非翻译区。
56、如本文所用，如果核酸的元件位于载体上，使得它们可以被转录而形成线性rna，然后可以使用本文提供的方法将所述线性rna环化成环状rna，则所述元件是“可操作地相连的(operably connected)”或“可操作地连接的(operably linked)”。
57、“多脱氧核糖核苷酸”、“脱氧核糖核酸”和“dna”意指包括经由磷酸二酯键聚合的多个脱氧核糖核苷酸的大分子。核苷酸可以是一磷酸核苷或多磷酸核苷。核苷酸意指包括可检测标签(诸如发光标签)或标志物(例如，荧光团)的多磷酸脱氧核糖核苷，例如三磷酸脱氧核糖核苷(dntp)，其可以选自三磷酸脱氧腺苷(datp)、三磷酸脱氧胞苷(dctp)、三磷酸脱氧鸟苷(dgtp)、三磷酸尿苷(dutp)和三磷酸脱氧胸苷(dttp)dntp。核苷酸可以包括可以掺入正在生长的核酸链中的任何亚基。此类亚基可以是a、c、g、t或u，或对一个或多个互补a、c、g、t或u有特异性或与嘌呤(即，a或g或其变体)或嘧啶(即c、t或u或其变体)互补的任何其他亚基。在一些实例中，多核苷酸是脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)或其衍生物或变体。在一些情况下，多核苷酸举几例来说是短干扰rna(sirna)、微小rna(mirna)、质粒dna(pdna)、短发夹rna(shrna)、小核rna(snrna)、信使rna(mrna)、前体mrna(前mrna)、反义rna(asrna)，并且涵盖核苷酸序列及其任何结构实施例，诸如单链、双链、三链、螺旋、发夹等。在一些情况下，多核苷酸分子为环状的。多核苷酸可以具有各种长度。核酸分子可以具有至少约10个碱基、20个碱基、30个碱基、40个碱基、50个碱基、100个碱基、200个碱基、300个碱基、400个碱基、500个碱基、1千碱基(kb)、2kb、3kb、4kb、5kb、10kb、50kb或更大的长度。可以从细胞或组织中分离多核苷酸。多核苷酸的实施例包括分离和纯化的dna/rna分子、合成的dna/rna分子以及合成的dna/rna类似物。
58、多核苷酸(例如多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸)的实施例可以包括一种或多种核苷酸变体，包括非标准核苷酸、非天然核苷酸、核苷酸类似物或经修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸的实例包括但不限于二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-d-半乳糖基q核苷、肌苷、n6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-d-甘露糖基q核苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-d46-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、q核苷(queosine)、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-n-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤等。在一些情况下，核苷酸在其磷酸酯部分中可以包括修饰，包括对三磷酸酯部分的修饰。此类修饰的非限制性实例包括长度更长的磷酸酯链(例如，具有4、5、6、7、8、9、10个或更多个磷酸酯部分的磷酸酯链)和带有硫醇部分(例如，α-硫代三磷酸酯和β-硫代三磷酸酯)的修饰。在实施例中，核酸分子在碱基部分(例如，在通常可用于与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处或者在通常不能与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处)、糖部分或磷酸酯主链处被修饰。在实施例中，核酸分子含有胺修饰的基团，诸如氨基烯丙基1-dutp(aa-dutp)和氨基己基丙烯酰胺-dctp(aha-dctp)，以允许共价附接胺反应性部分，诸如n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs)。本披露的寡核苷酸中标准dna碱基对或rna碱基对的替代物可以提供更高的密度(以位/立方毫米计)、更高的安全性(抗天然毒素的偶然或有目的合成)、更容易辨别光程序性聚合酶(photo-programmed polymerases)或较低的二级结构。与用于从头或扩增合成的天然和突变聚合酶相容的此类替代性碱基对在betz k,malyshev da,lavergne t,welte w,diederichs k,dwyer tj,ordoukhanian p,romesberg fe,marx a.nat.chem.biol.[自然化学生物学]2012年7月；8(7):612-4中描述，其通过援引并入本文用于所有目的。
59、如本文所用，“多肽”意指最常通过肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然的)的聚合物。如本文所用，所述术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。多肽可以包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同系物、直系同源物、旁系同源物、前述物质的片段和其他等同物、变体和类似物。多肽可以是单分子或多分子复合物，如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可以包括单链或多链多肽(如抗体或胰岛素)，并且可以是缔合的或连接的。最常见的二硫键存在于多链多肽中。术语多肽也可以适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。
60、如本文所用，术语“预防”意指降低发展疾病、障碍或病症(例如，病毒感染，例如hiv、sars-cov-2、hcv、流感或rsv)的可能性，或可替代地，降低随后发展的疾病或障碍的症状的严重程度或频率。可以将治疗剂施用于相对于一般群体成员而言发展病毒感染的风险增加的受试者，以便预防疾病或病症的发展或减轻疾病或病症的严重程度。可以例如在病毒感染的任何症状或表现发展之前将治疗剂作为预防剂施用。
61、如本文所用，术语“调控元件”是修饰环状或线性多核糖核苷酸内表达序列的表达的部分，诸如核酸序列。
62、如本文所用，“间隔子”是指在两个相邻多核苷酸区域之间提供距离或柔性的任何连续核苷酸序列(例如，一个或多个核苷酸的连续核苷酸序列)。
63、“信号序列”是指长度例如介于10至45个氨基酸之间的多肽序列，其存在于新生蛋白的多肽序列的n末端，将多肽序列靶向分泌途径。
64、如本文所用，术语“序列同一性”是通过使用全局或局部比对算法对两个肽或两个核苷酸序列进行比对来确定的。当序列在最佳比对时(例如，当通过程序(如gap或bestfit)使用默认参数进行比对时)共享至少某个最小百分比的序列同一性时，所述序列被称为“基本上相同的”或“基本上相似的”。gap使用needleman和wunsch全局比对算法在两个序列的整个长度上对其进行比对，从而最大程度地增加了匹配数目并最大程度地减少了空位数目。通常，使用gap默认参数，空位产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)，空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是nwsgapdna，而对于蛋白质，默认评分矩阵是blosum62(henikoff和henikoff,1992,pnas[美国科学院院报]89,915-919)。序列比对和百分比序列同一性的评分例如使用计算机程序来确定，所述计算机程序如从美国92121-3752加州圣地亚哥斯克兰顿路9685号的阿赛乐德公司(accelrys inc.,9685scranton road,san diego,ca)获得的gcg wisconsin软件包10.3版或embosswin2.10.0版(使用程序“needle”)。可替代地或另外，通过例如使用如fasta、blast等的算法对数据库进行搜索来确定同一性百分比。序列同一性是指在序列的整个长度上的序列同一性。
65、如本文所用，术语“受试者”是指生物，如动物、植物或微生物。在实施例中，受试者是脊椎动物(例如，哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物或两栖动物)。在实施例中，受试者是人。在实施例中，受试者是非人哺乳动物。在实施例中，受试者是非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物(例如猴、猿)、有蹄类动物(例如家牛、水牛、野牛、绵羊、山羊、猪、骆驼、美洲驼、羊驼、鹿、马、驴)、肉食动物(例如狗、猫)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠)或兔类动物(例如兔)。在实施例中，受试者是鸟，诸如禽类分类群鸡形目(例如鸡、火鸡、野鸡、鹌鹑)、雁形目(例如鸭、鹅)、古颚下纲(例如鸵鸟、鸸鹋)、鸽形目(例如鸽子、野鸽)或鹦形目(例如鹦鹉)的成员。在实施例中，所述受试者是无脊椎动物，如节肢动物(例如，昆虫、蛛形纲、甲壳动物)、线虫、环节动物、蠕虫、或软体动物。在实施例中，受试者是无脊椎动物农业有害生物或者寄生在无脊椎动物或脊椎动物宿主上的无脊椎动物。在实施例中，受试者是植物，诸如被子植物(其可以是双子叶植物或单子叶植物)或裸子植物(例如，针叶树、苏铁、买麻藤类植物、银杏)、蕨类、马尾植物、石松类或苔藓植物。在实施例中，受试者是真核藻类(单细胞或多细胞)。在实施例中，受试者是具有农业或园艺重要性的植物，诸如行间作物、生产水果的植物和树木、蔬菜、树木以及观赏植物(包括观赏花、灌木、树木、地被植物和草坪草)。
66、如本文所用，术语“抗融合多肽”是指抑制病毒融合相关事件(如病毒进入或病毒融合)的多肽，如10个和200个氨基酸之间的多肽。抗融合多肽包括例如表1的多肽。抗融合多肽包括多肽以及其任何生物活性片段(例如，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500个氨基酸的片段)。抗融合多肽包括，例如，靶向hiv、sars-cov-2、hcv或rsv的多肽。在一些实施例中，抗融合多肽包括与seq id no:1-324中任一个具有至少70％，例如至少80％，例如至少85％(例如，至少90％、95％、97％、99％或100％)的序列同一性的多肽。抗融合多肽也指编码抗融合多肽(例如，表1的多肽)的多核苷酸(例如多核糖核苷酸，例如环状多核糖核苷酸)或其生物活性片段。
67、如本文所用，术语“治疗(“treat”和“treating”)”是指对受试者中的病毒感染(例如hiv、sars-cov-2、hcv、流感或rsv)进行的预防性或治疗性治疗。治疗的效果可以包括逆转、减轻、降低疾病或者病毒感染的一种或多种症状或表现的严重程度，治愈疾病或者病毒感染的一种或多种症状或表现，抑制疾病或者病毒感染的一种或多种症状或表现的进展，降低疾病或者病毒感染的一种或多种症状或表现的复发的可能性，或者与不存在治疗性治疗的情况下病毒感染的状态或状况相比，稳定(即，不恶化)病毒感染的状态或者预防病毒感染的扩散。
68、如本文所用，术语“终止元件”是终止环状或线性多核糖核苷酸中表达序列的翻译的部分，诸如核酸序列。
69、如本文所用，术语“翻译效率”是从核糖核苷酸转录物产生蛋白质或肽的速率或量。在一些实施例中，翻译效率可以表示为给定量的编码蛋白或肽的转录物产生的蛋白或肽的量，例如在给定的时间段内，例如在给定的翻译系统(例如，无细胞的翻译系统，像兔网织红细胞裂解物)中。
70、如本文所用，术语“翻译起始序列”是在环状或线性多核糖核苷酸中起始表达序列的翻译的核酸序列。
71、如本文所用，“载体”意指一段dna，它是合成的(例如，使用pcr)或者取自病毒、质粒或高等生物体的细胞，可以或已经将外源dna片段插入其中以用于克隆或表达目的。在一些实施例中，载体可以稳定地维持在生物中。可选择标志物载体可以包括例如复制起点、可选择标志物或报告基因(诸如抗生素抗性或gfp)或多克隆位点(mcs)。所述术语包括线性dna片段(例如，pcr产物、线性化质粒片段)、质粒载体、病毒载体、粘粒、细菌人工染色体(bac)、酵母人工染色体(yac)等。在一个实施例中，本文提供的载体包括多克隆位点(mcs)。在另一实施例中，本文提供的载体不包括mcs。
1.一种环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含编码抗融合多肽的多核糖核苷酸货物。
2.如权利要求1所述的环状多核糖核苷酸，其中所述多核糖核苷酸货物包括编码所述抗融合多肽的表达序列。
3.如权利要求1或2所述的环状多核糖核苷酸，其中所述环状多核糖核苷酸包含连接5'外显子片段和3'外显子片段的剪接点。
4.如权利要求2或3所述的环状多核糖核苷酸，其中所述多核糖核苷酸货物包括与编码所述抗融合多肽的所述表达序列可操作地连接的ires。
5.如权利要求4所述的环状多核糖核苷酸，其中所述环状多核糖核苷酸进一步包含所述ires与所述3'外显子片段或所述5'外显子片段之间的间隔子区域。
6.如权利要求5所述的环状多核糖核苷酸，其中所述间隔子区域的长度为至少5个核糖核苷酸。
7.如权利要求6所述的环状多核糖核苷酸，其中所述间隔子区域的长度为5至500个核糖核苷酸。
8.如权利要求5-7中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中所述间隔子区域包含聚a、聚a-c、聚a-u或聚a-g序列。
9.如权利要求1-8中任一项所述的环状多核糖核苷酸，其中所述环状多核糖核苷酸的长度为至少500个核糖核苷酸。
10.如权利要求9所述的环状多核糖核苷酸，其中所述环状多核糖核苷酸的长度为500至20,000个核糖核苷酸。
11.一种线性多核糖核苷酸，所述线性多核糖核苷酸从5'到3'包括(a)3'内含子片段；(b)3'剪接位点；(c)3'外显子片段；(d)编码所述抗融合多肽的多核糖核苷酸货物；(e)5'外显子片段；(f)5'剪接位点；和(g)5'内含子片段。
12.如权利要求11所述的线性多核糖核苷酸，其中所述多核糖核苷酸货物包括编码所述抗融合多肽的表达序列。
13.如权利要求12所述的线性多核糖核苷酸，其中所述多核糖核苷酸货物包括与编码所述抗融合多肽的所述表达序列可操作地连接的ires。
14.如权利要求11-13中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中所述环状多核糖核苷酸进一步包括(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)中一个或多个之间的间隔子区域。
15.如权利要求14所述的线性多核糖核苷酸，其中所述间隔子区域的长度为至少5个核糖核苷酸。
16.如权利要求15所述的线性多核糖核苷酸，其中所述间隔子区域的长度为5至500个核糖核苷酸。
17.如权利要求14-16中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中所述间隔子区域包含聚a、聚a-c、聚a-u或聚a-g序列。
18.如权利要求11-17中任一项所述的线性多核糖核苷酸，其中所述线性多核糖核苷酸的长度为至少500个核糖核苷酸。
19.如权利要求18所述的线性多核糖核苷酸，其中所述线性多核糖核苷酸的长度为500至20,000个核糖核苷酸。
20.一种dna载体，所述dna载体编码如权利要求11-19中任一项所述的线性多核糖核苷酸。
21.一种在细胞中表达抗融合多肽的方法，所述方法包括在适于表达所述抗融合多肽的条件下向所述细胞提供如权利要求1-10中任一项所述的环状多核糖核苷酸、如权利要求11-19中任一项所述的线性多核糖核苷酸或如权利要求20所述的dna载体。
22.一种由如权利要求11-20中任一项所述的线性多核糖核苷酸产生环状多核糖核苷酸的方法，所述方法包括在适于所述线性多核糖核苷酸自剪接以产生所述环状多核糖核苷酸的条件下提供所述线性多核糖核苷酸。
23.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-10中任一项所述的环状多核糖核苷酸、如权利要求11-19中任一项所述的线性多核糖核苷酸或如权利要求20所述的dna载体以及稀释剂、载剂或赋形剂。
24.一种在受试者中表达抗融合多肽的方法，所述方法包括以足以在所述受试者中产生至少500ng/ml的血清浓度的所述抗融合多肽的量施用第一剂量的如权利要求23所述的药物组合物。
25.如权利要求24所述的方法，所述方法进一步包括施用第二剂量的所述药物组合物。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述第二剂量在所述药物组合物的所述第一剂量后至少1天施用。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述第二剂量在所述药物组合物的所述第一剂量后1天至90天施用。
28.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中在所述受试者的血清中所述抗融合多肽的血清浓度小于约500ng/ml之前施用所述第二剂量。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述方法在所述受试者中维持至少500ng/ml的血清浓度的所述抗融合多肽。
30.如权利要求24-29中任一项所述的方法，其中所述方法治疗或预防所述受试者中的病毒感染。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述药物组合物以足以治疗或预防所述病毒感染的量和持续时间施用给所述受试者。
32.如权利要求24-31中任一项所述的方法，其中所述方法减少病毒进入。
33.一种环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含编码多个抗融合多肽的多核糖核苷酸货物。
34.如权利要求33所述的环状多核糖核苷酸，其中所述多核糖核苷酸货物包括编码所述抗融合多肽的表达序列。
35.如权利要求33或34所述的环状多核糖核苷酸，其中所述抗融合多肽针对相同的病毒。
36.如权利要求33或34所述的环状多核糖核苷酸，其中所述抗融合多肽针对多于一种病毒。
