本发明大体涉及新型锌指降解决定子序列，其中所述锌指降解决定子包含至少一个杂合形式的非天然锌指结构域，其中所述非天然锌指结构域由来自第一锌指的第一部分和来自第二锌指的第二部分构成，优选地，其中第一部分包含第一锌指的β-发夹，第二部分包含第二锌指的α-螺旋。在优选的实施方案中，所述降解决定子标签还包含第二非天然杂合锌指结构域。在优选实施方案中，所述锌指结构域包含至少两个氨基酸置换。还提供了包含根据本发明的降解决定子标签的融合蛋白，以及根据本发明的降解决定子标签在涉及控制目标蛋白水平、细胞活性、表达等的方法中的用途。
背景技术：
1、背景说明包括可能有助于理解本发明的信息。并非承认本文提供的任何信息为现有技术或与当前请求保护的发明有关，也非承认任何具体或隐含引用的出版物为现有技术。
2、细胞行为在很大程度上由不同蛋白的表达水平控制，所述蛋白包括关键调节蛋白。为了实现对这种细胞行为的控制，已经开发了合成蛋白或人造蛋白稳定性控制工具，所述工具允许目标蛋白(poi)通过外源提供的因子，例如(小)化合物可逆和可滴定的表达，例如以分钟作为时间尺度。
3、特别是，已经开发了针对外源提供的因素如膜通透性小分子的控制poi蛋白水解速率(即蛋白降解速率，如细胞内蛋白降解)的策略。著名实例包括smash/asunaprevir(chung et al.nat chem biol.2015sep；11(9):713-20)，fkbp12f36v/dtag-13(nabet etal.nat chem biol.2018 may；14(5):431-441)，锌指降解决定子/imid(sievers etal.science.2018 nov 2；362(6414):eaat0572)，以及dd/shield1(haugwitz etal.biotechniques.2008 mar；44(3):432-3)平台。
4、这些平台以及这些平台所基于的原理为本领域技术人员所熟知，并且在科学文献和专利文献中已经有广泛描述(参见，例如，对于锌指降解决定子/imid wo2019007869，wo2020132039，wo2021188286，或wo2021080427)。
5、大多这些平台以及其中使用的方法涉及poi与小分子依赖型降解决定子结构域的融合(即，在调节蛋白质降解速率中重要的蛋白质结构域或部分)，在小分子调节因子的存在下，降解决定子(结构域)与蛋白酶体复合体的优选相互作用导致poi-降解决定子融合蛋白的随后降解。
6、备选地，poi可以与降解决定子结构域融合，所述降解决定子结构域本质上不稳定，因此易于蛋白质水解，通过小分子的添加使得折叠的蛋白质状态稳定被用于防止这种蛋白质水解。
7、poi也可以与调节结构域融合，所述调节结构域含有组成型活性降解决定子结构域、蛋白酶以及在poi和降解决定子标签之间的接头中相应的蛋白酶切割位点。在不存在蛋白酶抑制剂的情况下，降解决定子结构域被蛋白水解地从poi中去除，从而例如稳定poi的表达。相反，在蛋白酶抑制剂存在的情况下，诱导融合蛋白的降解。
8、尽管在可用于细胞治疗应用的蛋白质稳定性控制系统的开发上具有很大的兴趣，但将来仍存在许多挑战。例如，用于临床细胞治疗产品的优选蛋白稳定性调节剂应由人序列构成，以最大限度减小免疫介导排斥反应的风险，例如基于丙型肝炎病毒(hcv)衍生的ns3/4a蛋白酶的smash-标签降解决定子系统的免疫原性(tan et al,plos one.2017；12(7):e0181578)可能会限制其临床应用。
9、此外，蛋白质稳定性控制结构域的小分子调节剂应安全，且优选为获得临床批准。用于fkbp12f36v-标签降解决定子系统的dtag-13protac尚未获得临床批准，使得基于fkbp12f36v的调节系统的临床开发变得复杂。此外，protac分子的大尺寸被认为是这类药物给药和代谢的挑战(hu et al.chembiochem.2021sep 8.doi:10.1002/cbic.202100270.发表前在网上公开)。
10、此外，重要的是，足以诱导对蛋白质水平有生物学意义的控制的小分子浓度，例如对蛋白质降解(例如，融合到降解决定子的poi的降解)有意义的控制的小分子浓度优选应与临床使用兼容，特别是在长期小分子施用的背景下，这种施用的副作用可能会引起关注。
11、sievers et al.science.2018nov 2；362(6414):eaat0572描述了免疫调节亚胺药物(imid)可诱导的锌指降解决定子系统，将poi与短锌指降解决定子标签(有时也被称为锌指结构域和/或锌指多肽)融合，有助于招募poi-锌指融合降解决定子蛋白至imid/crbne3连接酶复合体中，例如在被称为imid的小分子存在的情况下。通常认为，imids与crl4crbn e3泛素连接酶的底物受体cereblon(crbn)结合，crbn可以通过与锌指降解决定子的相互作用招募含有锌指降解决定子标签的(融合)蛋白，所述相互作用是由imids如沙利度胺及其衍生物介导的。该锌指降解决定子系统基于人蛋白质序列，因此限制了免疫介导的排斥反应的风险。此外，蛋白质的稳定性由临床批准的小分子如沙利度胺、泊马度胺和来那度胺(作为imids的例子)调节，从而促进了这些系统的临床开发。
12、在临床前工作中，该蛋白稳定性控制系统已显示出其在临床相关应用中的价值，例如当这种锌指降解决定子与cars融合时对car-t细胞活性的调节(jan et al.scitransl med.2021jan 6；13(575):eabb6295)。此外，我们最近报道了imid/锌指系统在化学调节和sh2-递送-抑制尾(chemically regulated and sh2-delivered–inhibitory tail,crash-it)开关平台中的应用，所述平台允许控制多种细胞治疗平台(如car-t、tcr-t和nk细胞)的细胞活性水平(sahillioglu et al.,wo2021080427)。
13、虽然锌指降解决定子由人序列组成，并且可以使用已批准的分子进行控制的事实促进了该系统的临床应用，但在治疗有效浓度下，这些imid分子在血液肿瘤患者治疗中的临床应用与大量的副作用相关。例如，在一项评估高(每天25mg)和低(每天5mg)剂量来那度胺在多发性骨髓瘤患者维持疗法的研究中，来那度胺剂量显示与毒性和疗效两者相关，而在高剂量来那度胺队列中因毒性，尤其是嗜中性粒细胞减少，而降低剂量的情况常见。(fenk et al.clin cancer res.2020nov 15；26(22):5879-5886)./pct
14、由于与较高剂量imid使用相关的担忧，可在较低药物剂量下调节的新型锌指降解决定子序列的鉴定是具有吸引力的。
15、鉴于此，使用改进的和新型的锌指降解决定子序列来控制目标蛋白(表达)水平的新产品、组合物、方法和用途是非常理想的，但目前还不可用。特别是，本领域明确需要可靠、高效和可重复的产品、组合物、方法和用途，例如，在疾病治疗或预防中，允许使用新型锌指降解决定子序列(锌指降解决定子标签、结构域、多肽)以与临床使用兼容的方式调节目标蛋白的(表达)水平，例如允许使用降低浓度的小分子(较低的药物剂量)，特别是imids，所述小分子通过与降解决定子序列的相互作用来调节蛋白质的降解/稳定性，例如，与目标蛋白融合。因此，本发明的技术问题可见于提供符合任何上述需求的这种产品、组合物、方法和用途。通过权利要求和下文表征的实施方案来解决技术问题。
技术实现思路
1、本发明的范围由权利要求书限定。未被权利要求范围所涵盖的主题不构成本请求保护的发明的一部分。
1.降解决定子标签，其包含非天然第一杂合锌指结构域和非天然第二杂合锌指结构域，其中
2.前述权利要求中任一项所述的降解决定子标签，其中所述降解决定子标签能够结合在cereblon(crbn)与免疫调节药物(imid)之间形成的复合物。
3.前述权利要求中任一项所述的降解决定子标签，其中，所述第一部分是第一cys2-his2锌指结构域的β-发夹环，所述第二部分是第二cys2-his2锌指结构域的α-螺旋区域，所述第三部分是第三cys2-his2锌指结构域的β-发夹环，和/或所述第四部分是第四cys2-his2锌指结构域的α-螺旋区域。
4.前述权利要求中任一项所述的降解决定子标签，其中第一置换在第二部分中，第二置换在第一部分中或在第二部分中。
5.前述权利要求中任一项所述的降解决定子标签，其中至少一个置换在选自由x1、x4、x12、x13、x14、x15、x17、x21和x22组成的组中的位置。
6.前述权利要求中任一项所述的降解决定子标签，其中至少一个置换选自表1中所列的那些，优选地，其中至少两个置换各自独立地选自表1中所列的那些。
7.前述权利要求中任一项所述的降解决定子标签，其中至少两个置换选自表2中所列的那些。
8.前述权利要求中任一项所述的降解决定子标签，其中被置换的第一部分中的氨基酸和/或被置换的第二部分中的氨基酸选自表3中所列的那些。
9.前述权利要求中任一项所述的降解决定子标签，其中第一部分中和/或第二部分中被置换的至少两个氨基酸选自表4中所列的那些。
10.前述权利要求中任一项所述的降解决定子标签，其中：
11.前述权利要求中任一项所述的降解决定子标签，其中将至少两个氨基酸置换引入至以下第一杂合锌指结构域中，其第一部分具有根据seq id no:101的氨基酸序列，和/或其第二部分具有根据seq id no:102的氨基酸序列，和/或所述第一杂合锌指结构域具有根据seq id no:103的氨基酸序列。
12.前述权利要求中任一项所述的降解决定子标签，其中包含至少两个置换的第一杂合锌指结构域选自表5中所列的那些。
13.前述权利要求中任一项所述的降解决定子标签，其中所述第二杂合锌指结构域的第三部分包含根据seq id no:104的氨基酸序列，所述第二杂合锌指结构域的第四部分包含根据seq id no:105的氨基酸序列，和/或其中所述第二杂合锌指结构域包含根据seq idno:106的氨基酸序列。
14.前述权利要求中任一项所述的降解决定子标签，其中所述第一杂合锌指结构域与所述第二杂合锌指结构域相邻或通过接头肽连接。
15.非天然杂合锌指多肽，其包含第一杂合锌指结构域，所述第一杂合锌指结构域包含第一部分和第二部分，其中
16.前述权利要求中任一项所述的非天然杂合锌指多肽，其中非天然杂合锌指包含如前述权利要求1-15中任一项定义的第一杂合锌指结构域。
17.前述权利要求中任一项所述的非天然杂合锌指多肽，其进一步包含第二锌指结构域，其中所述第二锌指结构域为非杂合锌指结构域，优选选自ikzf1 zf3、ikzf3 zf3，以及zfp91 zf5、znf653 zf5、znf276 zf5和/或znf827 zf2、znf692 zf5。
18.前述权利要求中任一项所述的非天然杂合锌指多肽，其中所述第二锌指结构域相对于所述第一杂合锌指结构域为c末端。
19.前述权利要求中任一项所述的非天然杂合锌指多肽，其中所述第二锌指结构域选自ikzf1 zf3、ikzf3 zf3和/或其中所述第二锌指结构域包含根据seq id no：109-110的氨基酸序列。
20.融合蛋白，其包含权利要求1-15中任一项所述的降解决定子标签或根据权利要求16-19中任一项所述的的非天然杂合锌指多肽，所述融合蛋白进一步包含目标蛋白。
21.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述降解决定子标签或非天然杂合锌指多肽位于目标蛋白的n末端或c末端。
22.前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述目标蛋白选自cbl-b、socs1、cish、tox、eomes、il12、il15。
23.非天然存在的核酸，其编码权利要求1-15中任一项所述的降解决定子标签，根据权利要求16-19中任一项所述的非天然杂合锌指多肽，或根据权利要求20-22中任一项所述的融合蛋白。
24.载体，其包含权利要求23所述的非天然存在的核酸。
25.细胞或宿主细胞，其表达权利要求24所述的非天然存在的核酸。
26.提供权利要求1-15中任一项所述的降解决定子标签、根据权利要求16-19中任一项所述的非天然杂合锌指多肽、根据权利要求20-22中任一项所述的融合蛋白或编码这些的核酸的方法，所述方法包括：
27.根据权利要求26所述的方法，其进一步包含确定根据权利要求1-15中任一项所述的降解决定子标签、根据权利要求16-19中任一项的非天然杂合锌指多肽、根据权利要求20-22中任一项的融合蛋白用于免疫调节亚胺药物(imid)诱导的降解的的敏感性，优选地，其中所述imid选自沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、阿伐度胺、伊伯度胺、其盐及类似物。
28.降解目标蛋白或用于控制目标蛋白的表达的方法，其包含体外或体内使细胞与有效量的imid接触，其中所述细胞表达编码权利要求1-15中任一项的降解决定子标签、权利要求16-19中任一项的非天然杂合锌指多肽或/或权利要求20-22中任一项的融合蛋白的核酸。
29.权利要求28所述的方法，其中所述方法用于调节目标蛋白的活性。
30.降解目标蛋白或用于控制目标蛋白的表达的方法，其包含向受试者施用有效量的imid，其中所述受试者先前通过基因疗法进行了治疗，引起所述受试者中的至少一些细胞表达编码权利要求1-15中任一项的降解决定子标签、权利要求16-19中任一项的非天然杂合锌指多肽或权利要求20-22中任一项的融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含目标蛋白。
31.根据权利要求31所述的方法，其中基因疗法包含将细胞引入至所述受试者，其中所述引入的细胞表达编码权利要求1-15中任一项的降解决定子标签、权利要求16-19中任一项的非天然杂合锌指多肽或权利要求20-22中任一项的融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含目标蛋白。
32.权利要求1-15中任一项的降解决定子标签、权利要求16-19中任一项的非天然杂合锌指多肽或权利要求20-22中任一项的融合蛋白或编码这些中的任一种的核酸用于控制转录因子如eomes、tox，tcr信号转导的负调节因子如cbl-b，细胞因子受体的负调节因子如socs1、cish，膜结合细胞因子如il12、il15，抗原受体如tcr、car、nkr，检查点受体如pd1、lag3、tim3，核酸酶如cas9、talen或锌指核酸酶的用途。
