本发明涉及生物学，特别涉及一种基于李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗。
背景技术：
1、宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。原位癌高发年龄为30～35岁，浸润癌为45～55岁，近年来其发病有年轻化的趋势。近几十年宫颈细胞学筛查的普遍应用，使宫颈癌和癌前病变得以早期发现和治疗，宫颈癌的发病率和死亡率已有明显下降。治疗癌症的传统方法主要是手术切除、放疗、化疗和治疗性疫苗。手术切除、放疗、化疗易出现转移和复发等弊端，相比之下疫苗疗法的优点是对机体的伤害小、毒性低。目前针对肿瘤使用的疫苗主要是传统的灭活疫苗及亚单位疫苗，存在免疫周期长、免疫效果差等缺点。
2、基于细菌为载体的疫苗用作外源抗原传递具显著优势，包括生产成本低、遗传稳定性高、安全性较好且和具有高效的抗肿瘤作用，李斯特菌平衡致死系统是一种绿色载体系统，李斯特菌平衡致死系统因质粒高拷贝的特性可能具有更好的免疫效果，现有技术缺乏一种效果经可靠验证且制备方法简单的李斯特菌载体疫苗。
3、因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现思路
1、本发明提供了一种基于李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗，旨在解决背景技术中所提到的李斯特菌疫苗所存在的技术问题。
2、为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
3、本发明提供了一种基于李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗，所述宫颈癌治疗性疫苗由以下方式制得：
4、通过反向pcr、无缝克隆连接的方法用asd营养基因替换pcw-lmdal-amp回补质粒上的amp抗性基因，构建得到不含amp抗性基因的回补质粒pcw-lmdal-ampfree；
5、经酶切、pcr、无缝克隆连接的方法向回补质粒pcw-lmdal-ampfree中插入宫颈癌抗原基因，构建回补质粒pcw-hpvxxx-lmdal-ampfree；
6、将回补质粒pcw-hpvxxx-lmdal-ampfree转入单增李斯特菌营养缺陷株和/或绵羊李斯特菌营养缺陷株中,获得宫颈癌治疗性候选疫苗；
7、对宫颈癌治疗性候选疫苗进行生物学检测和治疗效果筛选，获得宫颈癌治疗性疫苗。
8、在本发明一种可选的实施方式中，所述宫颈癌抗原基因包括phly-ss-gp33-ha-e6e7-gp61。
9、在本发明一种可选的实施方式中，所述对宫颈癌治疗性候选疫苗进行生物学检测和治疗效果筛选，获得宫颈癌治疗性疫苗包括：
10、利用pcr检测宫颈癌治疗性候选疫苗所携带回补质粒pcw-hpvxxx-lmdal-ampfree的体外稳定性；
11、通过生化反应、体外生长情况、溶血实验测定宫颈癌治疗性候选疫苗的基本生物学特性；
12、提取宫颈癌治疗性候选疫苗的分泌蛋白和菌体蛋白，通过wb实验验证宫颈癌治疗性候选疫苗目的蛋白的体外表达情况。
13、在本发明一种可选的实施方式中，所述对宫颈癌治疗性候选疫苗进行生物学检测和治疗效果筛选，获得宫颈癌治疗性疫苗还包括：
14、利用改良蔻氏法测定宫颈癌治疗性候选疫苗的ld50，通过肝/脾/肺载菌量测定、肝/脾/肺脏器指数的测定、alt和ast的测定、小鼠体重变化情况测定及肝/脾/肺病理切片的制备及观察，评价宫颈癌治疗性候选疫苗的安全性；
15、以不同时间点肝/脾/肺研磨液滴板bh i平板生长的菌落为模板，利用pcr检测宫颈癌治疗性候选疫苗的体内稳定性；
16、利用流式细胞术检测小鼠脾细胞cd4+t细胞和cd8+t细胞中i fn-γ+、i l-2+、i l-12+和tnf-α+细胞的比率，测定宫颈癌治疗性候选疫苗的免疫原性。
17、在本发明一种可选的实施方式中，所述对宫颈癌治疗性候选疫苗进行生物学检测和治疗效果筛选，获得宫颈癌治疗性疫苗还包括：
18、通过皮下注射tc-1细胞建立宫颈癌荷瘤小鼠模型，采用lm-li-lm组合免疫方式，测定宫颈癌治疗性候选疫苗的治疗效果；
19、所述lm-li-lm组合免疫方式为第1次免疫单增李斯特菌宫颈癌治疗性候选疫苗，第2次免疫绵羊李斯特菌宫颈癌治疗性候选疫苗，第3次再免疫单增李斯特菌宫颈癌治疗性候选疫苗，且每次免疫之间间隔7天。
20、在本发明一种可选的实施方式中，所述对宫颈癌治疗性候选疫苗进行生物学检测和治疗效果筛选，获得宫颈癌治疗性疫苗还包括：
21、采用瘤内注射和尾静脉注射两种免疫方式，比较不同免疫方式对宫颈癌治疗性候选疫苗治疗效果的影响。
22、有益效果：本发明公开了一种基于李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗，由以下方式制得通过反向pcr和无缝克隆连接的方法用asd营养基因替换pcw-lmda l-amp回补质粒上的amp抗性基因，构建得到不含抗性基因的回补质粒pcw-lmda l-ampfree；经酶切、pcr和无缝克隆连接的方法向回补质粒pcw-lmda l-ampfree中插入宫颈癌抗原基因构建回补质粒pcw-hpvxxx-lmda l-ampfree；将回补质粒pcw-hpvxxx-lmda l-ampfree转入单增和/或绵羊李斯特菌营养缺陷株中,获得宫颈癌治疗性候选疫苗；对宫颈癌治疗性候选疫苗进行生物学检测和治疗效果筛选，获得宫颈癌治疗性疫苗。本发明的治疗性疫苗制备方法简单且经过效果验证筛选，具有更好的治疗效果。
1.一种基于李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗，其特征在于，所述宫颈癌治疗性疫苗由以下方式制得：
2.根据权利要求1所述的基于李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗，其特征在于，所述宫颈癌抗原基因包括phly-ss-gp33-ha-e6e7-gp61。
3.根据权利要求2所述的基于李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗，其特征在于，所述对宫颈癌治疗性候选疫苗进行生物学检测和治疗效果筛选，获得宫颈癌治疗性疫苗包括：
4.根据权利要求3所述的基于李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗，其特征在于，所述对宫颈癌治疗性候选疫苗进行生物学检测和治疗效果筛选，获得宫颈癌治疗性疫苗还包括：
5.根据权利要求4所述的基于李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗，其特征在于，所述对宫颈癌治疗性候选疫苗进行生物学检测和治疗效果筛选，获得宫颈癌治疗性疫苗还包括：
6.根据权利要求5所述的基于李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗，其特征在于，所述对宫颈癌治疗性候选疫苗进行生物学检测和治疗效果筛选，获得宫颈癌治疗性疫苗还包括：
