本发明涉及一种具有增强粘液渗透性的肝靶向外泌体纳米粒子及其制备方法和应用，属于高分子材料学和药物制剂领域。
背景技术：
1、糖尿病是以高血糖为主要特征的慢性疾病，属于代谢障碍型内分泌疾病，2型糖尿病占我国糖尿病患者的大多数，病程长的2型糖尿病患者常伴有严重并发症(nutr metab(lond),2017,14:60.)。目前临床主要通过注射外源胰岛素治疗糖尿病，但皮下注射剂量稍有偏差就会造成低血糖，而且糖尿病患者需要多次注射，会造成患者疼痛和局部皮肤组织坏死。口服胰岛素是一种便捷的胰岛素制剂，然而胃肠道作为最为主要的口服药物吸收部位，存在复杂的生理屏障严重阻碍了胰岛素的吸收。
2、外泌体外形为磷脂双分子层组成的立体球形结构，其主要脂质结构是胆固醇、饱和脂肪酸和鞘磷脂。外泌体不仅具有脂质筏的结构，并且与细胞膜一样，表面具有多种严格控制的相关蛋白和标记蛋白。外泌体可在细胞间进行蛋白质、核酸和脂质等分子的转运，常被用作信号分子的天然载体。外泌体具有生物相容性、循环稳定性、生物屏障通透性、低免疫原性和低毒性等优势，其纳米尺寸在50-150nm之间，可以逃避单核吞噬细胞系统的快速清除。基于以上特点，外泌体常被用作外源性治疗分子的载体。牛奶是一种日常生活中常见的食品，从牛奶中提取的牛奶外泌体性和免疫原性也可以忽略不计。2016年，gupta等人首次系统地证明牛奶可以作为外泌体获取来源，其口服后体内稳定性、生物相容性均表现优秀。并且牛奶外泌体作为两性物质，为兼具亲水和亲脂性质的药物载体，理论上在跨黏液层和跨肠粘膜细胞方面具有优势。
3、在对药物载体修饰上不同表面配体时，常常由于空间位阻和静电相互作用等因素阻碍载体与受体的结合，导致载体纳米粒子的功效和体内药物递送的效率受到影响。常用策略为利用酶响应原理将多个配体连接在纳米粒子上，并通过特定酶裂解该连接体使另一个配体暴露并发挥作用。但这样的操作会引入不别要的配体基团。
技术实现思路
1、发明目的：本发明第一目的是提供一种用于肝靶向外泌体递送的药物载体；本发明的第二目的是提供一种用于肝靶向外泌体递送的药物载体的制备方法；本发明的第三目的是提供一种具有增强粘液渗透性的肝靶向外泌体纳米粒子，本发的第四目的是提供具有增强粘液渗透性的肝靶向外泌体纳米粒子的制备方法，本发明的第五目的是提供该用于肝靶向外泌体递送的药物载体或具有增强粘液渗透性的肝靶向外泌体纳米粒子在制备治疗糖尿病中的应用。
2、技术方案：本发明所述一种用于肝靶向外泌体递送的药物载体，所述药物载体为肝靶向配体dspe-peg-pep，其结构式如下：
3、
4、其中n代表聚乙二醇的平均数。
5、优选地，肝靶向配体dspe-peg-pep中的peg为peg2000(peg2k)、peg3400或peg5000。更优选地，peg为peg2000。
6、另一方面，本发明提供一种上述的用于肝靶向外泌体递送的药物载体的制备方法，其特征在于，所述方法为：
7、
8、马来酰亚胺-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(dspe-peg-mal)与肝靶向ph触发的可拉伸细胞穿透肽pep-cys通过迈克尔加成的方式修饰得到肝靶向配体dspe-peg-pep。上述技术方案中，使用了ph响应性可拉伸细胞穿透肽(pep r6g5(he)10(简称pep-cys))，pep模拟病毒表面的刺突蛋白，会根据ph值发生构象变化。正常环境中，pep呈现拉伸构象，在肠道环境中表面会发生延伸，介导穿过肠道屏障。进入体循环后pep会发生折叠，将其肝靶向功能片段暴露在表面，从而实现引导药物递送至肝脏。
9、马来酰亚胺-聚乙二醇兼具亲水性和疏水性，用其制备的递送材料可以明显改善循环时间和稳定封装药物，并且可以通过很好的修饰使其携带目标配体或靶向物质。选择dspe-peg基团作为主体，可以使其与配体片段嵌合进外泌体载药系统中，其类似磷脂双分子层的结构在被巨噬细胞捕获及跨膜方面具有优势。
10、上述技术方案综合使用以上材料技术，制备同时具有高效肠道跨膜转运能力、克服胃肠道屏障能力、肝靶向能力和生物相容性极佳的口服药物载体，有效提高了降糖药物的生物利用度。
11、进一步地，所述肝靶向的药物载体的制备方法具体为：在氮气保护环境下，用有机溶剂溶解dspe-peg-mal与肝靶向ph触发的可拉伸细胞穿透肽pep-cys，加入催化剂，室温搅拌反应，反应结束后收集产物，即为肝靶向配体dspe-peg-pep。
12、更具体的，所述肝靶向的药物载体的制备方法为：在氮气保护环境下，用少量有机溶剂溶解dspe-peg-mal与肝靶向ph触发的可拉伸细胞穿透肽pep-cys，加入几滴催化剂，室温搅拌反应。反应结束后用冰乙醚沉淀并离心取下层沉淀，洗涤干燥，得到肝靶向配体dspe-peg-pep；
13、进一步地，所述有机溶剂为dmf、甲醇或三氯甲烷。
14、进一步地，所述催化剂为三乙胺。
15、进一步地，所述肝靶向配体dspe-peg-pep是通过dspe-peg-mal的双键与肝靶向多肽序列pep-cys的巯基通过迈克尔加成反应连接的，dspe-peg-mal与肝靶向ph触发的可拉伸细胞穿透肽pep-cys的摩尔比为1-1.5:1。
16、进一步地，所述冰乙醚沉淀时，反应溶液与冰乙醚的体积比为1:4-10。
17、另一方面，本发明提供一种外泌体的提取方法为：先除去材料中的大分子物质及沉淀，再取上清液离心除去囊泡及小分子的物质，最后使用高速离心管及超高速冷冻离心机使外泌体沉淀。
18、具体的，所述外泌体的提取，是使用低温高速离心多次离心外泌体材料，除去材料中的大分子物质及沉淀。再使用超高速冷冻离心机离心除去囊泡等小分子等物质。最后转移上清液至高速离心管，再次使用超高速冷冻离心机离心，并使用pbs洗涤沉淀，最终得到外泌体溶液。
19、进一步地，外泌体的提取中，高速离心机设定程序为10000-13000g，30-60min。
20、进一步地，外泌体的提取中，超高速冷冻离心机除去囊泡等物质时设定程序为80000-110000g，30-60min；沉淀外泌体时设定程序为130000-200000g，30-60min。
21、优选地，所述外泌体的来源包括乳源外泌体、生姜外泌体和细胞外泌体中的任意一种。
22、另一方面，本发明提供一种肝靶向外泌体纳米粒子，所述肝靶向外泌体纳米粒子包括上述的肝靶向配体dspe-peg-pep、外泌体和胰岛素；其中外泌体以自组装的方式装载胰岛素，再与肝靶向配体共孵育得到所述的肝靶向外泌体纳米粒子。
23、其中，所述以自组装的方式装载胰岛素制备载药纳米粒子，是将提取得到的外泌体与胰岛素混合，用细胞超声破碎仪超声处理获得的。
24、其中，肝靶向ph触发的可拉伸细胞穿透肽pep r6g5(he)10(简称pep-cys)可替换为阳离子肽聚-l-精氨酸(简称parg)。
25、另一方面，本发明提供一种肝靶向外泌体纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
26、胰岛素溶液与外泌体溶液混合，混匀后超声处理，其充分混合组装得到的载药纳米粒子记为mexo@ins；
27、取dspe-peg-pep溶液与mexo@ins混合共孵育，孵育结束后，离心除去未连接的配体结构，所得肝靶向载药纳米粒子为dspe-peg-pep-mexo@ins。
28、具体的，肝靶向外泌体纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：提前用ph 2.0的盐酸溶液为溶剂溶解牛胰岛素，制备浓度为20mg/ml的胰岛素溶液。制备载药纳米粒子溶液mexo@ins时，取胰岛素溶液与牛奶外泌体溶液混合，混匀后用细胞超声破碎仪超声处理，其充分混合组装得到的载药纳米粒子记为mexo@ins。取dspe-peg-pep溶于pbs溶液，制备浓度为10mg/ml的配体溶液，dspe-peg-pep溶液与mexo@ins混合，在摇床保温箱中共孵育一段时间。孵育结束后，使用离心机离心除去未连接的配体结构，得到肝靶向外泌体载药纳米粒子。
29、进一步地，肝靶向外泌体纳米粒子的制备中，所述超声处理的超声程序为75-120w，2-5min。
30、进一步地，肝靶向外泌体纳米粒子的制备中，所述dspe-peg-pep溶液与mexo@ins混合时，体积比为1:5-10。
31、进一步地，肝靶向外泌体纳米粒子的制备中，除去未连接配体时，所述离心条件为2000-3500r·min-1，3-5min。
32、具体的，肝靶向外泌体纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
33、(1)肝靶向配体的制备：
34、按照1:1-1.5的比例精密称取dspe-peg-mal和肝靶向ph触发的可拉伸细胞穿透肽(pep-cys)固体，溶解于dmf中，并加入三滴三乙胺催化反应。反应全过程在n2的保护下进行。反应结束后，将反应获得的粘稠液体逐滴加入到冰乙醚(体积为反应液的4-6倍)中沉淀，将含有絮状沉淀的冰乙醚放入-20℃冰箱中冷藏，待产品完全析出，将产品离心。取沉淀部分并真空干燥。
35、(2)牛奶外泌体的提取：
36、将牛奶加入50ml离心管中，配平后按12000g或13000g，30-40min的程序离心两次，弃去沉淀以除去体细胞及脂肪。取上清液于新50ml离心管，按上清液：edta(300-600mmol/l)为3-4:1的体积比混合，在冰上静置以沉淀牛奶酪蛋白。
37、再次配平后，在80000-100000g程序下离心60min，以除去脂肪球、沉淀的蛋白质和较大的囊泡。取上清液至高速离心管，使用超高速冷冻离心机在130000-150000g程序下离心60min，弃去上清液。沉淀用磷酸缓冲液(pbs溶液)洗涤重悬三遍，最后使用pbs溶液溶解沉淀，所得溶液为外泌体溶液。
38、(3)配体修饰的载药纳米粒子的制备：
39、提前用ph 2.0的盐酸溶液为溶剂溶解牛胰岛素，制备浓度为20mg/ml的胰岛素溶液。制备载药纳米粒子时，取胰岛素溶液加入中制备的牛奶外泌体溶液中，制备载胰岛素量为30wt％的纳米粒子。混匀后用细胞超声破碎仪按75-100w的程序超声处理3min，使其充分混合组装，得到的载药纳米粒子记为mexo@ins。
40、取步骤(1)中制备的dspe-peg-pep溶于pbs溶液，制备肝靶向配体溶液，dspe-peg-pep溶液与上述操作制备的mexo@ins按体积比1:10-15比例混合，在37℃，80r/min摇床保温箱中孵育。孵育结束后，使用离心机按2000-3000r/min程序离心5min，除去未连接的配体dspe-peg-pep，得到载药体系为dspe-peg-pep-mexo@ins。
41、另一方面，本发明提供一种上述的用于肝靶向外泌体递送的药物载体在制备治疗糖尿病药物中的应用。
42、另一方面，本发明提供一种上述的肝靶向外泌体纳米粒子在制备治疗糖尿病药物中的应用。进一步地，应用时，配制外泌体溶液，加入降糖药物胰岛素，以自组装的方式制备外泌体载药纳米粒子。配制肝靶向配体溶液，与外泌体载药纳米粒子混合孵育，制备肝靶向外泌体载药纳米粒子。纳米粒子使用方式为口服。
43、本发明所述的肝靶向外泌体纳米粒子是先由dspe-peg-mal与肝靶向多肽序列(pep)通过迈克尔加成的方式修饰得到肝靶向配体(dspe-peg-pep)，用超高速冷冻离心机多次离心含外泌体的原料以获取外泌体。之后外泌体以自组装的方式装载胰岛素，再与肝靶向配体共孵育得到所述的肝靶向外泌体纳米粒子。
44、本发明首次合成并使用了具有肝靶向功能的配体基团修饰的外泌体载药系统，pep基团不仅提供了肝靶向效果，作为ph响应性可拉伸细胞穿透肽，可以通过调节配体的构象，使其具有类似病毒的独特表面特征，从而充分发挥多种配体的多种功能，避免它们之间的相互干扰。牛奶外泌体作为常见的内源性的天然配基，具有极好的生物相容性，有效降低药物的毒副作用，其较小的纳米尺寸可以逃避吞噬细胞的快速清除。dspe-peg基团的引入，使药物兼具亲水和亲脂效果，并使载体表现为电中性，在维持载体系统稳定性、跨黏液层和跨膜方面有较大的优势。多种载体联合使用，实现药物长效循环，在糖尿病的治疗方面有潜在的应用前景。
45、有益效果：相对于现有技术，具有如下优势：
46、(1)本发明设计的外泌体纳米粒子以乳源外泌体作为主要载体，外泌体作为重要的口服药物载体，其本身具有极好的生物相容性、长效循环效果及封装生物大分子的内在能力等优点。乳源性外泌体存在胃肠道运输过程中的ph自适应、肠道粘液渗透、细胞膜多靶点主动摄取以及激活营养同化相关通路等优势，在维持口服载体稳定性、肠粘液层渗透性、穿透细胞膜方面具有极大优势。
47、(2)肝靶向ph触发的可拉伸细胞穿透肽(pep-cys)会根据ph值发生构象变化，这有助于避免不同基团之间的相互干扰。药物在消化道ph下，pep采用拉伸构象，介导有效穿过肠道屏障。药物进入体循环后，pep在生理ph下折叠，dspe-peg基团发挥作用，从而特异性地将药物引导至肝脏。肝靶向技术的应用能够增加药物在肝脏中的蓄积，发挥精准治疗作用，提高口服给药的生物利用度，实现药物较长效循环。使胰岛素直接作用于肝脏上的胰岛素受体，促进肝脏对葡萄糖的摄取并将其转化为肝糖原，有效提高了胰岛素的生物利用度。
48、(3)本发明利用碳碳双键与巯基的迈克尔加成反应，在大分子化合物上修饰目标分子，操作简便，条件简单。
49、(4)本发明利用离心法获取外泌体，且外泌体来源为乳源外泌体，获取方式简单，材料口服毒性小，生物相容性好。
1.一种用于肝靶向外泌体递送的药物载体，其特征在于，所述药物载体为肝靶向配体dspe-peg-pep，其结构式如下：
2.一种根据权利要求1所述的用于肝靶向外泌体递送的药物载体的制备方法，其特征在于，所述方法为：
3.根据权利要求2所述的用于肝靶向外泌体递送的药物载体的制备方法，其特征在于，所述方法具体为：在氮气保护环境下，用有机溶剂溶解dspe-peg-mal与肝靶向ph触发的可拉伸细胞穿透肽pep-cys，加入催化剂，室温搅拌反应，反应结束后收集产物，即为肝靶向配体dspe-peg-pep。
4.根据权利要求3所述的用于肝靶向外泌体递送的药物载体的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为dmf、甲醇或三氯甲烷；
5.一种肝靶向外泌体纳米粒子，其特征在于，所述肝靶向外泌体纳米粒子包括权利要求1所述的肝靶向配体dspe-peg-pep、外泌体和胰岛素；其中外泌体以自组装的方式装载胰岛素，再与肝靶向配体共孵育得到所述的肝靶向外泌体纳米粒子。
6.根据权利要求5所述的肝靶向外泌体纳米粒子，其特征在于，所述外泌体的来源包括乳源外泌体、生姜外泌体和细胞外泌体中的任意一种。
7.一种肝靶向外泌体纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述肝靶向外泌体纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述外泌体的提取方法为：先除去材料中的大分子物质及沉淀，再取上清液离心除去囊泡及小分子的物质，最后使用高速离心管及超高速冷冻离心机使外泌体沉淀。
9.根据权利要求7所述肝靶向外泌体纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述超声处理的超声程序为75-120w，2-5min；
10.一种权利要求1所述的用于肝靶向外泌体递送的药物载体或权利要求5或6所述的肝靶向外泌体纳米粒子在制备治疗糖尿病药物中的应用。
