本发明涉及一种使目的蛋白有效分泌的体内自组装靶向系统，属于生物。
背景技术：
1、基因治疗(gene therapy)是将目的基因导入患者的特定组织和细胞进行适当的表达，以纠正或补偿因基因缺陷或异常而引起的疾病，从而达到治疗疾病的目的。纠正的途径既可以是原位修复有缺陷的基因，也可以是用有功能的正常基因转入患者体内的某一部位，以替代缺陷基因来发挥作用。与传统治疗方法相比，基因治疗能够从根源上修正引起疾病的异常基因，优势显著。
2、由于裸露的基因具有在组织或细胞中易被核酶降解和细胞靶向能力差等缺陷，因此，将外源的基因导入患者体内必须借助一定的技术方法或载体。目前，常用的基因治疗药物通常由含有目的基因的载体或递送系统组成，其通过在患者细胞内，利用“细胞工厂”进一步表达目的蛋白或编辑细胞基因发挥功能。
3、若能针对不同疾病设计不同的基因治疗药物，将会有效提高疾病的治疗效果和治疗效率。其中，基于目的蛋白表达的基因治疗药物需要能够在患者体内长期有效的分泌目的蛋白，然而，受限于当前的设计水平，大部分基于目的蛋白表达的基因治疗药物仍不能满足此要求。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本发明提供了一种使目的蛋白有效分泌的体内自组装靶向系统，所述体内自组装靶向系统为表达核酸分子的重组质粒；所述核酸分子编码基于目的蛋白的融合蛋白；所述基于目的蛋白的融合蛋白包括依次相连的前肽、靶向肽以及目的蛋白；所述靶向肽用于将目的蛋白递送至其作用靶点。
2、在本发明的一种实施方式中，所述基于目的蛋白的融合蛋白还包括连接肽。
3、在本发明的一种实施方式中，所述连接肽连接于靶向肽和目的蛋白之间。
4、在本发明的一种实施方式中，所述目的蛋白包括成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子变体、血小板衍生生长因子(pdgf)、白细胞介素(ils)和/或肿瘤坏死因子(tnf)。
5、在本发明的一种实施方式中，所述成纤维细胞生长因子包括fgf1和/或fgf4；所述成纤维细胞生长因子变体包括fgf1变体和/或fgf4变体。
6、在本发明的一种实施方式中，所述白细胞介素包括白细胞介素-1(il-1)～白细胞介素-35(il-35)中的一种或一种以上。
7、在本发明的一种实施方式中，所述肿瘤坏死因子包括肿瘤坏死因子-α(tnf-α)和/或肿瘤坏死因子-β(tnf-β)。
8、在本发明的一种实施方式中，所述目的蛋白为fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)；所述fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)的氨基酸序列如seq id no.1所示。
9、在本发明的一种实施方式中，当目的蛋白为fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)时，所述基于目的蛋白的融合蛋白包括依次相连的前肽、靶向肽、连接肽以及fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)。
10、在本发明的一种实施方式中，当目的蛋白为fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)时，所述前肽的氨基酸序列如seq id no.2所示。
11、在本发明的一种实施方式中，当目的蛋白为fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)时，所述靶向肽为中枢靶向肽；所述中枢靶向肽包括脑靶向的嵌合狂犬病毒糖蛋白片段肽(rvg)、脑靶向的狂犬病毒糖蛋白衍生肽(rdp)、胶质瘤靶向肽(angiopep-2)、转铁蛋白靶向肽(thr)、细胞穿膜肽(peptide-22)和/或载脂蛋白e片段肽(apoe(159-167)2)；所述脑靶向的嵌合狂犬病毒糖蛋白片段肽的氨基酸序列如seq id no.3所示。
12、在本发明的一种实施方式中，当目的蛋白为fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)时，所述连接肽为柔性连接肽(柔性linker)；所述柔性连接肽包括gs连接肽(gslinker)；所述gs连接肽的氨基酸序列如seq id no.4所示。
13、在本发明的一种实施方式中，当目的蛋白为fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)时，所述基于目的蛋白的融合蛋白由依次相连的前肽、中枢靶向肽、连接肽以及fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)组成。
14、在本发明的一种实施方式中，当目的蛋白为fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)时，所述基于目的蛋白的融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示。
15、在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pcdna6.2-gw/emgfp-mir质粒和/或pcdna3.1质粒。
16、在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的制备方法包括：将载体进行线性化，得到线性化载体；将线性化载体和核酸分子连接，得到重组质粒。
17、本发明还提供了一种基于目的蛋白的融合蛋白，所述基于目的蛋白的融合蛋白包括依次相连的前肽、靶向肽以及目的蛋白；所述靶向肽用于将目的蛋白递送至其作用靶点。
18、在本发明的一种实施方式中，所述基于目的蛋白的融合蛋白还包括连接肽。
19、在本发明的一种实施方式中，所述连接肽连接于靶向肽和目的蛋白之间。
20、在本发明的一种实施方式中，所述目的蛋白包括成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子变体、血小板衍生生长因子(pdgf)、白细胞介素(ils)和/或肿瘤坏死因子(tnf)。
21、在本发明的一种实施方式中，所述成纤维细胞生长因子包括fgf1和/或fgf4；所述成纤维细胞生长因子变体包括fgf1变体和/或fgf4变体。
22、在本发明的一种实施方式中，所述白细胞介素包括白细胞介素-1(il-1)～白细胞介素-35(il-35)中的一种或一种以上。
23、在本发明的一种实施方式中，所述肿瘤坏死因子包括肿瘤坏死因子-α(tnf-α)和/或肿瘤坏死因子-β(tnf-β)。
24、在本发明的一种实施方式中，所述目的蛋白为fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)；所述fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)的氨基酸序列如seq id no.1所示。
25、在本发明的一种实施方式中，当目的蛋白为fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)时，所述基于目的蛋白的融合蛋白包括依次相连的前肽、靶向肽、连接肽以及fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)。
26、在本发明的一种实施方式中，当目的蛋白为fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)时，所述前肽的氨基酸序列如seq id no.2所示。
27、在本发明的一种实施方式中，当目的蛋白为fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)时，所述靶向肽为中枢靶向肽；所述中枢靶向肽包括脑靶向的嵌合狂犬病毒糖蛋白片段肽(rvg)、脑靶向的狂犬病毒糖蛋白衍生肽(rdp)、胶质瘤靶向肽(angiopep-2)、转铁蛋白靶向肽(thr)、细胞穿膜肽(peptide-22)和/或载脂蛋白e片段肽(apoe(159-167)2)；所述脑靶向的嵌合狂犬病毒糖蛋白片段肽的氨基酸序列如seq id no.3所示。
28、在本发明的一种实施方式中，当目的蛋白为fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)时，所述连接肽为柔性连接肽(柔性linker)；所述柔性连接肽包括gs连接肽(gslinker)；所述gs连接肽的氨基酸序列如seq id no.4所示。
29、在本发明的一种实施方式中，当目的蛋白为fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)时，所述基于目的蛋白的融合蛋白由依次相连的前肽、中枢靶向肽、连接肽以及fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)组成。
30、在本发明的一种实施方式中，当目的蛋白为fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)时，所述基于目的蛋白的融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示。
31、本发明还提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码上述体内自组装靶向系统或上述基于目的蛋白的融合蛋白。
32、在本发明的一种实施方式中，当编码上述基于目的蛋白的融合蛋白，且目的蛋白为fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)时，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no.6所示。
33、在本发明的一种实施方式中，当编码上述体内自组装靶向系统，且目的蛋白为fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)时，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no.7所示。
34、本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞携带上述体内自组装靶向系统；或者，所述宿主细胞表达上述基于目的蛋白的融合蛋白；或者，所述宿主细胞的基因组整合有上述核酸分子。
35、在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞包括大肠杆菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞、枯草芽孢杆菌和/或酵母菌。
36、本发明还提供了上述体内自组装靶向系统或上述基于目的蛋白的融合蛋白或上述核酸分子或上述宿主细胞在制备药物中的应用。
37、在本发明的一种实施方式中，当目的蛋白为fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)时，所述药物为用于治疗糖尿病的药物。
38、在本发明的一种实施方式中，所述糖尿病为二型糖尿病。
39、在本发明的一种实施方式中，所述药物还包括药物载体；所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
40、在本发明的一种实施方式中，所述纳米粒包括脂质纳米颗粒(lnp)。
41、在本发明的一种实施方式中，所述药物为脂质纳米颗粒包裹的上述体内自组装靶向系统。
42、在本发明的一种实施方式中，所述脂质纳米颗粒的成分包含可电离脂质、胆固醇、辅助脂质以及聚乙二醇(peg)脂质；所述可电离脂质包括阳离子脂质体sm-102；所述辅助脂质包括二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)；所述聚乙二醇脂质包括peg-dmg-2000。
43、本发明还提供了一种药物，所述药物包括上述体内自组装靶向系统、上述基于目的蛋白的融合蛋白、上述核酸分子和/或上述宿主细胞。
44、在本发明的一种实施方式中，当目的蛋白为fgf1变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)时，所述药物为用于治疗糖尿病的药物。
45、在本发明的一种实施方式中，所述糖尿病为二型糖尿病。
46、在本发明的一种实施方式中，所述药物还包括药物载体；所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
47、在本发明的一种实施方式中，所述纳米粒包括脂质纳米颗粒(lnp)。
48、在本发明的一种实施方式中，所述药物为脂质纳米颗粒包裹的上述体内自组装靶向系统。
49、在本发明的一种实施方式中，所述脂质纳米颗粒的成分包含可电离脂质、胆固醇、辅助脂质以及聚乙二醇(peg)脂质；所述可电离脂质包括阳离子脂质体sm-102；所述辅助脂质包括二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)；所述聚乙二醇脂质包括peg-dmg-2000。
50、本发明技术方案，具有如下优点：
51、1、本发明提供了一种体内自组装靶向系统，所述体内自组装靶向系统为表达核酸分子的重组质粒，所述核酸分子编码基于目的蛋白的融合蛋白，所述基于目的蛋白的融合蛋白包括依次相连的前肽、靶向肽以及目的蛋白。此体内自组装靶向系统表达的融合蛋白将前肽前置，研究表明，此体内自组装靶向系统能够实现目的蛋白在哺乳动物体内的长期有效表达，在制备基于目的蛋白表达的基因治疗药物中具有极大的应用前景。
52、进一步地，所述目的蛋白为成纤维细胞生长因子变体；所述成纤维细胞生长因子变体的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述基于成纤维细胞生长因子的融合蛋白包括依次相连的前肽、靶向肽、连接肽以及成纤维细胞生长因子变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)；所述靶向肽为中枢靶向肽。此体内自组装靶向系统表达的融合蛋白将前肽前置，研究表明，此体内自组装靶向系统能够通过颅内注射以外的方式(皮下注射、静脉注射)穿过血脑屏障并特异性到达中枢神经系统，发挥持久的降糖作用(至少可以持续稳定降糖13周)，且不引起不良反应，既保留了成纤维细胞生长因子的抗糖尿病活性，也避免了成纤维细胞生长因子的致瘤风险，同时，解决了颅内注射导致的患者依从性低的问题，为开发中枢靶向药物提供了更多思路，在二型糖尿病的治疗中极具应用前景。
53、2、本发明提供了一种基于目的蛋白的融合蛋白，所述基于目的蛋白的融合蛋白包括依次相连的前肽、靶向肽以及目的蛋白。此融合蛋白将前肽前置，研究表明，将此融合蛋白整合至表达载体组成体内自组装靶向系统后，能够实现目的蛋白在哺乳动物体内的长期有效表达，在制备基于目的蛋白表达的基因治疗药物中具有极大的应用前景。
54、进一步地，所述目的蛋白为成纤维细胞生长因子变体；所述成纤维细胞生长因子变体的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述基于成纤维细胞生长因子的融合蛋白包括依次相连的前肽、靶向肽、连接肽以及成纤维细胞生长因子变体(fgf1非促分裂改构体fgf1δhbs)；所述靶向肽为中枢靶向肽。此融合蛋白将前肽前置，研究表明，将此融合蛋白整合至表达载体组成体内自组装靶向系统后，能够通过颅内注射以外的方式(皮下注射、静脉注射)穿过血脑屏障并特异性到达中枢神经系统，发挥持久的降糖作用(至少可以持续稳定降糖13周)，且不引起不良反应，既保留了成纤维细胞生长因子的抗糖尿病活性，也避免了成纤维细胞生长因子的致瘤风险，同时，解决了颅内注射导致的患者依从性低的问题，为开发中枢靶向药物提供了更多思路，在二型糖尿病的治疗中极具应用前景。
1.一种使目的蛋白有效分泌的体内自组装靶向系统，其特征在于，所述体内自组装靶向系统为表达核酸分子的重组质粒；所述核酸分子编码基于目的蛋白的融合蛋白；所述基于目的蛋白的融合蛋白包括依次相连的前肽、靶向肽以及目的蛋白；所述靶向肽用于将目的蛋白递送至其作用靶点。
2.如权利要求1所述的体内自组装靶向系统，其特征在于，所述基于目的蛋白的融合蛋白还包括连接肽；所述连接肽连接于靶向肽和目的蛋白之间。
3.如权利要求1或2所述的体内自组装靶向系统，其特征在于，所述目的蛋白包括成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子变体、血小板衍生生长因子、白细胞介素和/或肿瘤坏死因子。
4.一种基于目的蛋白的融合蛋白，其特征在于，所述基于目的蛋白的融合蛋白包括依次相连的前肽、靶向肽以及目的蛋白；所述靶向肽用于将目的蛋白递送至其作用靶点。
5.如权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述基于目的蛋白的融合蛋白还包括连接肽；所述连接肽连接于靶向肽和目的蛋白之间。
6.如权利要求4或5所述的融合蛋白，其特征在于，所述目的蛋白包括成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子变体、血小板衍生生长因子、白细胞介素和/或肿瘤坏死因子。
7.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～3任一项所述的体内自组装靶向系统或权利要求4～6任一项所述的融合蛋白。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞携带权利要求1～3任一项所述的体内自组装靶向系统；或者，所述宿主细胞表达权利要求4～6任一项所述的融合蛋白；或者，所述宿主细胞的基因组整合有权利要求7所述的核酸分子。
9.权利要求1～3任一项所述的体内自组装靶向系统或权利要求4～6任一项所述的融合蛋白或权利要求7所述的核酸分子或权利要求8所述的宿主细胞在制备药物中的应用。
10.一种药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1～3任一项所述的体内自组装靶向系统、权利要求4～6任一项所述的融合蛋白、权利要求7所述的核酸分子和/或权利要求8所述的宿主细胞。
