本发明属于生物医疗新材料领域，具体公开了一种基于凝胶细胞生长的乳酸菌生物膜制备方法及其应用。
背景技术：
1、需氧性阴道炎(av)是一种阴道感染，其特征是粘膜充血、疼痛、炎症、需氧菌增加和乳酸杆菌减少，这会增加性传播疾病(例如hiv)和早产的风险。在临床常规中，经验性使用抗生素是需氧型阴道炎的主要治疗方法；然而，抗生素会不分青红皂白地杀死阴道中的致病菌和有益菌株，导致阴道菌群失衡和高复发率。此外，过度使用抗生素可能导致多重耐药病原菌的发展，进一步影响治疗效果。
2、乳杆菌属通过多种机制在维持阴道稳态和健康方面发挥关键作用，包括竞争性地排除病原菌、分泌抗菌物质(例如乳酸、h2o2和抗菌肽等)以及调节宿主的免疫系统。因此，将活的乳酸菌输送到患病阴道已成为对抗av和调节阴道微环境的一种可接受的手段。尽管益生菌单一疗法具有一定效果，但其治疗效率仍然很低，因为大多数益生菌在成功定植和在专属阴道环境中存活之前会迅速清除或失去活性。为了达到持久的效果，必须给予多剂量的乳酸菌以改善细胞定植，但这会大大增加治疗成本并降低患者的依从性。最近，一些有吸引力的工程益生菌策略被开发出来，以保护它们免受恶劣条件的影响，并增强其定植能力，这在生物医学应用中显示出巨大的前景。然而，这些方法中的大多数是为治疗肠道疾病而设计的，关于维持女性生殖健康的研究很少。此外，动态评估益生菌活性仍然是一个巨大的挑战，导致实际应用中的治疗结果不可预测。因此，迫切需要开发新型治疗性益生菌制剂用于阴道炎诊断和治疗。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本发明提供一种基于凝胶细胞生长的乳酸菌生物膜制备方法及其应用。
2、本发明包括以下技术方案：
3、一种基于凝胶细胞生长的乳酸菌生物膜制备方法，包括以下步骤：
4、1)将阴道上皮细胞培养直至长成完整的细胞片层；
5、2)将光引发剂与聚乙二醇二丙烯酸酯混合，制备成凝胶化缓冲液加入到细胞片层中孵育；
6、3)使用pbs洗涤后，利用紫外灯照射引发聚合反应，形成胶体化细胞片层gcs；
7、4)将上述gcs与浮游的乳酸菌pla孵育，去除未结合的乳酸菌后，加入mrs培养基培养形成生物膜；
8、5)将氯化钙滴在生物膜上，用藻酸盐溶液包覆生物膜表面，去除多余的藻酸盐，得最终产品基于凝胶细胞生长的乳酸菌生物膜gcs-lb。
9、优选的，上述一种基于凝胶细胞生长的乳酸菌生物膜制备方法，所述步骤2)中光引发剂为2-羟基-4’-(2-羟基乙氧基)-2-甲基丙苯酮，所述所述光引发剂在凝胶化缓冲液中的终浓度为1.2～1.5g/ml；所述步骤2)中凝胶液中聚乙二醇二丙烯酸酯浓度为5～10wt％，分子量范围为500～1000da；凝胶液与阴道细胞片层孵育时间为5～10min。
10、优选的，上述一种基于凝胶细胞生长的乳酸菌生物膜制备方法，所述步骤3)中紫外灯的波长为365nm，照射时间为5～10min，紫外灯功率为10～50w。
11、优选的，上述一种基于凝胶细胞生长的乳酸菌生物膜制备方法，所述步骤4)中，所述加入的乳酸菌od600为1；所述浮游乳酸菌与凝胶细胞片层孵育时间为2h，洗去游离乳酸菌后，继续孵育48～72h。
12、优选的，上述一种基于凝胶细胞生长的乳酸菌生物膜制备方法，所述步骤5)中，所述氯化钙终浓度为20mm；所述氯化钙与生物膜的孵育时间为10min。
13、本发明还公开了一种基于凝胶细胞生长的乳酸菌生物膜gcs-lb，由上述的方法制备获得。
14、本发明还公开了上述制备方法和乳酸菌生物膜gcs-lb在制备治疗需氧性阴道炎的药物或医疗器械中的用途。
15、进一步的，本发明公开了一种dna修饰的阴道上皮细胞凝胶化细胞片支持的乳酸菌生物膜dna-gcs-lb的制备方法，包括以下步骤：
16、1)合成酸性敏感的dna双链，包括一个i-motif链(is)和一个信号链(ss)；然后，将两条链混合孵育，加入gcs-lb孵育，加入反应缓冲液，洗涤两次去除多余的dna，得到dna-gcs-lb，将dna-gcs-lb保存在低温以供后续使用；优选的，所述i-motif链(is)：5'-胆固醇-tttttttccctaaccctaaccctaaccc-猝灭基团(bhq3)-3'，所述信号链(ss)：5’-cy5(荧光基团)-gggttagggttagggtt/cy7(荧光基团)/ttttt-(胆固醇)-3’；所述的dna的终浓度为2um，与gcs-lb孵育时间为1h；所述反应缓冲液组分为1×pbs，2mm mgcl2溶液。
17、本发明还公开了一种dna修饰的阴道上皮细胞凝胶化细胞片支持的乳酸菌生物膜dna-gcs-lb，由上述的方法制备获得。
18、本发明还公开了乳酸菌生物膜dna-gcs-lb在制备诊断或治疗需氧性阴道炎的药物或医疗器械中的用途。
19、在一些实施例中，我们通过活体成像系统评估乳酸杆菌在小鼠阴道中的定植。小鼠阴道给予pla(1×107cfus)、gcs或gcs-lb(1×106cfu)后，在不同的时间点进行荧光测量。如图4所示，在注射后4小时用pla处理小鼠后，观察到明显变弱的荧光信号。这些结果表明，普通pla可以迅速从体内排出，并且信号在48小时时完全消失，这意味着单次接种不足以成功地定殖乳酸杆菌。相反，gcs-lb在阴道中的滞留时间显著延长，即使在注射后96小时仍可见。同样值得注意的是，乳酸杆菌的荧光甚至在最初的8小时内增加，这可能是由于细菌的快速增殖。所述活体成像仪为上海天能tanon abl x6。
20、在一些实施例中，我们公开了dna-gcs-lb在小鼠av模型中的治疗应用：小鼠腹腔注射β-雌二醇，每隔两天注射一次，连续6天。第7天，将20μl大肠杆菌注入阴道，每日1次，连续5天，然后正常喂养。成功构建小鼠av模型后，小鼠阴道内注射pbs、pla，gcs-lb。第7天，用无菌pbs(20μl)反复冲洗阴道，移液5次，获得阴道分泌物，用于琼脂平板上大肠杆菌和乳酸杆菌细胞活力的定量分析，如图5所示，注入gcs-lb的小鼠阴道内乳酸菌活性最高。所述β-雌二醇的终浓度为1mg/ml；所述构建av炎注入阴道的大肠杆菌浓度为1×109cfu/ml；所述阴道内注射pla和gcs-lb的浓度分别为1×107cfus、1×106cfus，所述阴道内注射pbs浓度为1×pbs。
21、在一些实施例中，我们公开了dna-gcs-lb在小鼠阴道微环境ph检测(乳酸杆菌的活性)中的应用：由于dna纳米器件能够在酸性环境下产生荧光信号，因此可通过活体成像观察使用ph感应dna纳米器件来动态监测生物膜中的ph变化。小鼠阴道内注射pbs,gcs-lb(1×106cfus),dna-gcs-lb(1×106cfus),或dna-gcs-ilb(1×106cfus)，在不同时间点进行或活体成像系统测量。如图6所示，使用cy7荧光可以很容易地区分健康阴道中的dna-gcs-lb，并且cy5信号在注射后4小时达到最大值，这表明乳酸杆菌在小鼠阴道中产生乳酸。所述dna-gcs-lb注入阴道体积为20ul；所述dna-gcs-lb中的乳酸菌生物膜为活菌，所述dna-gcs-ilb中乳酸菌生物膜被高温灭活。
22、本发明具有以下有益效果：
23、本发明公开了一种基于凝胶细胞生长的乳酸菌生物膜制备方法及其应用，其原理在于：乳酸菌可天然粘附在阴道上皮细胞上，这是益生菌粘附和定植的理想底物，为维持乳酸菌的活性和增殖提供足够的营养(即糖原)，如图1所示。首先，将阴道上皮细胞培养在平板上长成完整的片层结构，这一过程不仅保留了上皮细胞的主要特征，而且由于细胞内水凝胶的形成，大大提高了细胞的稳定性，使其适合于体外和体内的应用。然后，将乳酸菌接种在凝胶的细胞片上，彻底清洗去除多余的细菌。在mrs肉汤培养基中培养48h后，细胞薄片上形成了一个厚厚的益生菌生物膜。生物膜中的细菌产生各种可溶性微生物产物(smps)和胞外聚合物物质(epss)，以保护它们在恶劣环境下存活率更高；在此基础上进一步的，采用dna纳米装置引入gcs系统，它包括一个i-motif链(is)和一个信号链(ss)。该系统用于实时监测益生菌活性或者微环境的变化。当阴道内乳酸菌占主要优势菌群时，随着ph值的降低，is迅速折叠成一个紧凑的i-基序结构，导致双脱杂交和cy5荧光的恢复。对ph变化不敏感的“始终开启”的cy7荧光团产生了稳定的荧光信号，可以直接定位体内的生物膜，从而达到动态检测阴道内ph水平的变化。
24、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
25、由于凝胶化的细胞薄片的存在，生物膜形成能力相对较差的乳酸菌仍然可以形成较厚的生物膜，并保护它们免受不同不利条件的影响。与浮游乳酸菌(pla)相比，gcs-lb/dna-gcs-lb具有几个吸引人的特点：
26、1.增强了对不同压力的抵抗能力；
27、2.延长小鼠阴道保留时间；
28、3.所开发的dna纳米装置可以动态和远程监测体内益生菌的活性，而不需要繁琐的分泌物收集和ph测试步骤；
29、4.对av的治疗效果更好。
1.一种基于凝胶细胞生长的乳酸菌生物膜制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于凝胶细胞生长的乳酸菌生物膜制备方法，其特征在于，所述步骤2)中光引发剂为2-羟基-4’-(2-羟基乙氧基)-2-甲基丙苯酮，所述所述光引发剂在凝胶化缓冲液中的终浓度为1.2～1.5g/ml；所述步骤2)中凝胶液中聚乙二醇二丙烯酸酯浓度为5～10wt％，分子量范围为500～1000da；凝胶液与阴道细胞片层孵育时间为5～10min。
3.根据权利要求1所述的一种基于凝胶细胞生长的乳酸菌生物膜制备方法，其特征在于，所述步骤3)中紫外灯的波长为365nm，照射时间为5～10min，紫外灯功率为10～50w。
4.根据权利要求1所述的一种基于凝胶细胞生长的乳酸菌生物膜制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，所述加入的乳酸菌od600为1；所述浮游乳酸菌与凝胶细胞片层孵育时间为2h，洗去游离乳酸菌后，继续孵育48～72h。
5.根据权利要求1所述的一种基于凝胶细胞生长的乳酸菌生物膜制备方法，其特征在于，所述步骤5)中，所述氯化钙终浓度为20mm；所述氯化钙与生物膜的孵育时间为10min。
6.一种基于凝胶细胞生长的乳酸菌生物膜gcs-lb，其特征在于，由权利要求1-5任一项所述的方法制备获得。
7.如权利要求6所述的乳酸菌生物膜gcs-lb在制备治疗需氧性阴道炎的药物或医疗器械中的用途。
8.一种dna修饰的阴道上皮细胞凝胶化细胞片支持的乳酸菌生物膜dna-gcs-lb的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.一种dna修饰的阴道上皮细胞凝胶化细胞片支持的乳酸菌生物膜dna-gcs-lb，其特征在于，由权利要求8所述的方法制备获得。
10.如权利要求9所述的乳酸菌生物膜dna-gcs-lb在制备诊断或治疗需氧性阴道炎的药物或医疗器械中的用途。
