1.本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及一种利用低共熔溶剂提取香榧假种皮中多酚类化合物的方法。
背景技术：2.香榧(torreya grandis)，别名榧树、榧子等，为裸子植物门，红豆杉科榧树属的常绿针叶乔木，为我国特有树种、国家二级保护植物，主产于江浙等地。榧树花期4月，种子翌年10月成熟。研究发现，榧树中化学成分的主要结构类型有黄酮类、木脂素类、二萜类、脂肪酸类、挥发油类和氨基酸类等。现代药理学研究发现其具有抗菌、驱虫、镇咳、抗病毒和抗肿瘤作用，此外香榧叶提取物被报道具有抗疲劳和抗氧化作用。
3.多酚类物质是指一组植物中化学物质的统称，因具有多个酚基团而得名。多酚类物质包含40多种化学成分，不仅具有抗氧化、缓解焦虑情绪、抗失眠、增加抵抗力与降低血脂的作用；还有降血压、抑菌及抗癌功效。多酚类物质的功效作用越来越受科学界的关注。植物酚类物质在抗氧化、抗肿瘤、消炎、抗菌以及预防心血管疾病等方面均有显著的活性，也有研究学者指出中草药的生理活性与其中的酚类物质有直接关系。提取香榧假种皮中的多酚物质可为医药和保健品的开发寻找新的途径；对科学和有效地开发利用生物资源具有十分重要的意义。
4.低共熔溶剂(des)是近些年才快速兴起的一类优良绿色溶剂。与传统有机溶剂相比，低共熔溶剂具有价格低廉、配制简单、化学性质稳定、易于储存、无毒性及可生物降解等优点，是一种理想的传统有机溶剂替代溶剂和天然产物绿色提取溶剂。低共熔溶剂在天然产物提取方面有着广泛应用，已有研究人员报道用来提取黄酮类、酚类、多糖、蛋白质、花青素和生物碱等物质。
技术实现要素：5.本发明目的是提供一种利用低共熔溶剂提取香榧假种皮中多酚类化合物的方法。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种利用低共熔溶剂提取香榧假种皮中多酚类化合物的方法，包括以下步骤：
8.(1)香榧假种皮预处理
9.将新鲜采集的香榧假种皮烘干，使用粉碎机粉碎后，获得干燥的香榧假种皮粉末备用；
10.(2)酶液配置
11.将纤维素酶、果胶酶分别溶于ph＝5的pbs缓冲液中，得到纤维素酶液、果胶酶液；
12.(3)制备低共熔溶剂
13.将氯化胆碱和三乙二醇混合，添加水后置于60～70℃下搅拌均匀，得到低共熔溶剂；
14.所述氯化胆碱和三乙二醇的摩尔比为1：2～6，优选1：5.2；
15.所得低共熔溶剂中含水量在0～20％；
16.(4)提取多酚类化合物
17.在步骤(1)准备好的香榧假种皮粉末中加入步骤(2)配置的纤维素酶溶液和果胶酶溶液，于25～35℃下酶解2～4h，然后加入步骤(3)制备的低共熔溶剂，超声辅助提取1～3h，得到香榧假种皮多酚粗提液，离心，收集上清液，即为香榧假种皮多酚提取液；
18.所述纤维素酶液、果胶酶液均为2000u/ml；纤维素酶液在总酶液中的体积占比为50～60％，优选57％；
19.超声功率为240w，超声时间为2h，提取料液比为1g：50～80ml，优选1g：72ml。
20.一种利用低共熔溶剂提取香榧假种皮中多酚类化合物的工艺优化方法，所述的工艺优化方法为：
21.(1)筛选出5个影响香榧假种皮多酚提取率的因素：提取溶剂的种类、低共熔溶剂中氢键供体和氢键受体的摩尔比、低共熔溶剂的含水量、总酶液中纤维素酶液的占比、提取料液比；
22.(2)以香榧假种皮多酚提取液中多酚含量为指标，对步骤(1)筛选出的5个因素进行单因素实验；
23.(3)根据步骤(2)的单因素实验结果，选取对香榧假种皮多酚提取液总酚含量影响较为显著的三个因素：低共熔溶剂中氢键供体和氢键受体的摩尔比(a)、提取料液比(b)、总酶液中纤维素酶液的占比(c)为自变量，以香榧假种皮提取液多酚含量为响应值，采用box-behnken设计-响应面法设计三因素三水平的响应面分析试验；
24.应用统计学软件design-expert 12.0对上述响应面试验设计数据进行回归拟合分析，得到香榧假种皮提取液总酚含量(y)的二次多项回归方程预测模型y＝36.13+0.5869a+1.32b-0.1852c-0.2510ab+0.1003ac-1.11bc-1.61a
2-3.73b
2-1.23c2；应用统计学软件design-expert 12.0对提取工艺进行优化，得到最佳提取工艺条件，并根据所得最佳提取工艺进行验证试验；
25.最佳提取工艺条件为：低共熔溶剂(des)中氢键受体和氢键供体的摩尔比1:5.16157、提取料液比1:71.9566g/ml、总酶液中纤维素酶液占比56.87％；香榧假种皮多酚提取液总酚含量预测值为36.3175mg/g(香榧假种皮粉干重)。
26.本发明所得香榧假种皮提取液中的总酚含量使用酒石酸亚铁法进行测定，具体步骤如下：
27.步骤一、称取5.0mg没食子酸粉末溶于去离子水中，至100ml容量瓶定容，分别吸取5，10，15，20ml至25ml容量瓶定容，即得到没食子酸标准系列溶液，于室温下保存待用；
28.步骤二、称取0.1g七水合硫酸亚铁和0.5g四水酒石酸钾钠溶于去离子水中，定容至100ml，得到酒石酸亚铁溶液，于室温下保存待用；
29.步骤三、取1.0ml水以及上述没食子酸标准溶液于试管中，加入1.0ml酒石酸亚铁溶液，加入3.0ml ph＝7.5的磷酸缓冲液，在540nm波长下测定吸光度；
30.步骤四、以没食子酸浓度为横坐标，540nm波长下吸光度为纵坐标，制作没食子酸浓度标准曲线，得到线性方程：y＝0.0024x-0.0002，r2＝0.9997；
31.步骤五、将本发明得到的多酚提取液稀释1倍，将该溶液代替没食子酸标准溶液，
按照步骤三测定稀释的多酚提取液于540nm波长下的吸光度值；
32.步骤六、根据步骤四得到的没食子酸标准曲线回归方程，计算香榧假种皮多酚提取液总酚含量，公式如下：总酚含量(mg/g)＝[(y+0.002)
×v×
n]/(0.0024
×
m)，其中，y为540nm波长下的吸光度值，v为香榧假种皮多酚提取液体积(ml)，n为香榧假种皮多酚提取液稀释倍数；0.002为所述线性回归方程的截距，0.0024为该方程的斜率，m为香榧假种皮粉末干重(g)。
[0033]
本发明的有益效果在于：
[0034]
本发明所提供的香榧假种皮多酚的提取方法以新型绿色低共熔溶剂为提取剂，避免了传统有机溶剂的使用，从根本上解决了多酚传统化学提取中有机溶剂的大量使用所带来的高成本、高风险、高危害以及高污染等一系列问题。
[0035]
本发明所提供的香榧假种皮多酚的提取方法将低共熔溶剂与酶解与超声辅助提取三种提取方式有机地结合到香榧假种皮多酚地提取中，此方法提取的多酚类化合物与常规提取法相比含量提高了447％，本发明方法新颖、绿色环保、且香榧假种皮多酚提取率高，提取成本低，提取条件温和，提取工艺简单且稳定可靠，提取能耗低。
附图说明
[0036]
图1为des摩尔比和提取料液比对香榧假种皮多酚提取液总酚含量影响的响应面三维示意图。
[0037]
图2为des摩尔比和纤维素酶占比对香榧假种皮多酚提取液总酚含量影响的响应面三维示意图。
[0038]
图3为提取料液比和纤维素酶占比对香榧假种皮多酚提取液总酚含量影响的响应面三维示意图。
[0039]
图4为没食子酸浓度标准曲线。
[0040]
图5为提取溶剂对香榧假种皮多酚提取液总酚含量的影响示意图。
[0041]
图6为des摩尔比对香榧假种皮多酚提取液总酚含量的影响示意图。
[0042]
图7为des含水量对香榧假种皮多酚提取液总酚含量的影响示意图。
[0043]
图8为纤维素酶占比对香榧假种皮多酚提取液总酚含量的影响示意图。
[0044]
图9为提取料液比对香榧假种皮多酚提取液总酚含量的影响示意图。
具体实施方式
[0045]
以下参考说明书附图介绍本发明地多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式地实施例来得以体现，本发明的保护范围并不仅限于此：
[0046]
本发明所述香榧，别名榧树、榧子等，为裸子植物门，红豆杉科榧树属的常绿针叶乔木，为我国特有树种、国家二级保护植物，主产于江浙等地。
[0047]
实施例1：一种酶解耦合超声辅助低共熔溶剂提取香榧假种皮多酚的方法
[0048]
1植物样本采集：新鲜的香榧假种皮采于浙江省金华市，香榧假种皮置于实验室烘箱中于60℃烘干。烘干后的香榧假种皮置于50g手提式高速万能粉碎机中，于25000rpm/min的转速下研磨30s，得到香榧假种皮粉末，并将其密封于袋中保存待用。
[0049]
2低共熔溶剂配置：按照1:2摩尔比称取13.96g氯化胆碱和30g三乙二醇于内置有磁力搅拌转子的烧杯(100ml)中，并加入7.20ml的水。随后，将烧杯置于恒温水浴磁力搅拌器中，于65℃下恒温加热搅拌直至清澈透明、均一的液体形成(约1-1.5h)，即为氯化胆碱-三乙二醇低共熔溶剂，冷却至室温后待用。
[0050]
3酶液配置：准确称取0.25g纤维素酶(400u/mg)和0.20g果胶酶(500u/mg)溶于ph5的磷酸盐缓冲液中并定容至50ml。分别得2000u/ml的纤维素酶液和果胶酶液。ph5的磷酸盐缓冲液配置如下：准确称取27.2g磷酸二氢钾粉末溶于去离子水中并定容至1000ml，使用氢氧化钠溶液调节至ph5。
[0051]
4香榧假种皮多酚提取液的制备：精确称取0.10g香榧假种皮粉于10ml离心管中，加入0.6ml的纤维素酶溶液和0.4ml的果胶酶溶液，于30℃水浴锅中酶解3h。后加入4ml氯化胆碱-三乙二醇低共熔溶剂(提取料液比为1:40)，将该离心管置于超声清洗仪中，使用超声清洗仪对香榧假种皮多酚进行辅助提取，得到香榧假种皮多酚粗提液。最后，将香榧假种皮多酚粗提液于8000rpm离心10min，获得的上清液即为香榧假种皮多酚提取液，于2-8℃下保存待用。其中，超声辅助提取条件为：超声功率240w，超声时间2h。
[0052]
5酒石酸亚铁溶液的配置：称取0.1g七水合硫酸亚铁和0.5g四水酒石酸钾钠溶于去离子水中，定容至100ml，得到酒石酸亚铁溶液，于室温下保存待用；
[0053]
6ph7.5磷酸盐缓冲液的配置：准确称取9.08g磷酸二氢钾和15.22g磷酸氢二钾，溶于去离子水并定容至1000ml。
[0054]
7没食子酸标准系列溶液的配制：称取5.0mg没食子酸粉末溶于去离子水中，至100ml容量瓶定容，分别吸取5.0，10.0，15.0，20.0ml至25ml容量瓶定容，即获得浓度为10.0μg/ml、20.0μg/ml、30.0μg/ml、40.0μg/ml及50.0μg/ml的没食子酸标准系列溶液，于室温下保存待用。
[0055]
8没食子酸标准曲线的绘制：取6支15ml试管，取1.0ml上述步骤7没食子酸标准溶液于试管中，加入1.0ml步骤5所述的酒石酸亚铁溶液，加入3.0ml步骤6所述的ph7.5磷酸盐缓冲液，在540nm波长下测定吸光度；同时，以1.0ml去离子水代替没食子酸标准溶液，按上述方法进行空白实验。最终，以没食子酸浓度为横坐标，540nm波长下吸光度值为纵坐标，制作没食子酸浓度标准曲线(如图4所示)，得到线性回归方程：y＝0.0024x-0.0002，相关系数r2＝0.9997，表明没食子酸标准品在10.0-50.0μg/ml的范围内呈现良好的线性关系。
[0056]
9香榧假种皮多酚提取液总酚含量的测定：以1.0ml步骤4所述香榧假种皮多酚提取液代替步骤8所述没食子酸标准溶液，测定样品于540nm波长下的吸光度值，并根据步骤8所述没食子酸标准曲线回归方程，按如下公式计算香榧假种皮多酚提取液总酚含量：
[0057]
总酚含量(mg/g香榧假种皮粉干重)＝[(y+0.002)
×v×
n]/(0.0024
×
m)＝[(0.509+0.002)
×5×
1]/(0.0024
×
0.1
×
1000)＝10.6458
[0058]
实施例2：一种酶解耦合超声辅助低共熔溶剂提取香榧假种皮多酚工艺条件的优化方法，所述具体步骤如下：
[0059]
1根据前述的一种酶解耦合超声辅助低共熔溶剂提取香榧假种皮多酚的方法，筛选出5个影响多酚提取率的因素，包括提取溶剂的选择、低共熔溶剂配制时两种原料的配比、低共熔溶剂配制时的水分添加量、香榧假种皮粉末与低共熔溶剂的料液比、纤维素酶与果胶酶的比例。以香榧假种皮多酚提取液总酚含量为参考指标，进行单因素实验。
[0060]
1.1根据前述的一种酶解耦合超声辅助低共熔溶剂提取香榧假种皮多酚的方法，选取8种不同的低共熔溶剂以及两种不同浓度的乙醇进行提取溶剂的单因素实验：固定氢键受体-氢键供体摩尔比为1:2、低共熔溶剂配制时的水分添加量为20％、提取料液比为1:50g/ml、添加纤维素酶和果胶酶总酶液中纤维素酶占比为60％、超声辅助的条件不变，测定提取溶剂为氯化胆碱-甘油、氯化胆碱-葡萄糖、氯化胆碱-尿素、氯化胆碱-乙二醇、氯化胆碱-1,4-丁二醇、氯化胆碱-1,3-丁二醇、氯化胆碱-三乙二醇、氯化胆碱-柠檬酸、50％乙醇、80％乙醇时香榧假种皮多酚提取液的总酚含量。
[0061]
提取溶剂对香榧假种皮多酚提取液总酚含量的影响如图5所示，可以看出，当提取溶剂为氯化胆碱-1,3-丁二醇、氯化胆碱-三乙二醇时香榧假种皮多酚提取液总酚含量较高。
[0062]
1.2根据前述的一种酶解耦合超声辅助低共熔溶剂提取香榧假种皮多酚的方法，选取6种不同的氯化胆碱与氢键供体的摩尔比例进行单因素实验：固定低共熔溶剂为氯化胆碱-1,3-丁二醇和氯化胆碱-三乙二醇、低共熔溶剂配制时的水分添加量为20％、提取料液比为1:50g/ml、添加纤维素酶和果胶酶总酶液中纤维素酶占比为60％、超声辅助的条件不变，测定低共熔溶剂氯化胆碱与氢键供体的摩尔比为1:1，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6时香榧假种皮多酚提取液的总酚含量。
[0063]
低共熔溶剂配制时氯化胆碱与氢键供体的摩尔比对香榧假种皮多酚提取液总酚含量的影响如图6所示，可以看出，随着氯化胆碱与氢键供体摩尔比的增加，香榧假种皮多酚提取液总酚含量呈先增长后降低的趋势，当摩尔比为1:5时香榧假种皮多酚提取液总酚含量达到最大值。随后，香榧假种皮多酚提取液总酚含量开始降低。且氯化胆碱-三乙二醇的提取率普遍比氯化胆碱-1,3-丁二醇大。故最佳低共熔溶剂的选择为摩尔比为1:5的氯化胆碱-三乙二醇。
[0064]
1.3根据前述的一种酶解耦合超声辅助低共熔溶剂提取香榧假种皮多酚的方法，选取7个水平进行低共熔溶剂配制时水分添加量的单因素实验，固定低共熔溶剂为氯化胆碱-三乙二醇且摩尔比为1：5、提取料液比为1:50g/ml、添加纤维素酶和果胶酶总酶液中纤维素酶占比为60％、超声辅助的条件不变，测定低共熔溶剂配制时的水分添加量为0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％时香榧假种皮多酚提取液的总酚含量。
[0065]
低共熔溶剂配制时水分添加量对香榧假种皮多酚提取液总酚含量的影响如图7所示，可以看出，香榧假种皮多酚提取液的总酚含量随低共熔溶剂配制时水分添加量的增加呈现降低的趋势，水分添加量为0％时香榧假种皮多酚提取液的总酚含量最高。故最佳低共熔溶剂配制时的水分添加量为0％。
[0066]
1.4根据前述的一种酶解耦合超声辅助低共熔溶剂提取香榧假种皮多酚的方法，选取6个水平进行添加纤维素酶和果胶酶的比例的单因素实验，固定低共熔溶剂为氯化胆碱-三乙二醇且摩尔比为1：5、提取料液比为1:50g/ml、低共熔溶剂配制时的水分添加量为20％、超声辅助的条件不变，测定纤维素酶和果胶酶总酶液中纤维素酶占比为0％，20％，40％，60％，80％，100％时香榧假种皮多酚提取液的总酚含量。
[0067]
添加纤维素酶和果胶酶总酶液中纤维素酶占比对香榧假种皮多酚提取液总酚含量的影响如图8所示，可以看出，香榧假种皮多酚提取液的总酚含量随纤维素酶比例的增加呈现先增长后降低的趋势，添加纤维素酶和果胶酶总酶液中纤维素酶占比为60％时香榧假
种皮多酚提取液的总酚含量最高。故最佳纤维素酶占比为60％。
[0068]
1.5根据前述的一种酶解耦合超声辅助低共熔溶剂提取香榧假种皮多酚的方法，选取9个水平进行提取料液比的单因素实验，固定低共熔溶剂为氯化胆碱-三乙二醇且摩尔比为1：5、低共熔溶剂配制时的水分添加量为20％、纤维素酶和果胶酶总酶液中纤维素酶占比为60％、超声辅助的条件不变，测定料液比为1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100时香榧假种皮多酚提取液的总酚含量。
[0069]
提取料液比对香榧假种皮多酚提取液总酚含量的影响如图9所示，可以看出，香榧假种皮多酚提取液的总酚含量随料液比的增加呈现先增长后降低的趋势，料液比为1:70时香榧假种皮多酚提取液的总酚含量最高。故最佳最佳料液比为1:70。
[0070]
2根据上述单因素实验结果，选取对香榧假种皮多酚提取液总酚含量影响较为显著的三个因素：低共熔溶剂氯化胆碱与氢键供体的摩尔比(a)、提取料液比(b)、纤维素酶占比(c)为自变量，以香榧假种皮提取液多酚含量为响应值，采用box-behnken设计法设计三因素三水平的响应面分析试验，响应面试验设计因素与水平如表1所示，实验设计与结果如表2所示。
[0071]
表1：响应面试验设计因素与水平
[0072][0073]
表2：响应面试验设计与结果
[0074]
[0075][0076]
3应用统计学软件design-expert 12.0对表2数据进行回归拟合分析，得到香榧假种皮提取液总酚含量(y)的二次多项回归方程预测模型y＝36.13+0.5869a+1.32b-0.1852c-0.2510ab+0.1003ac-1.11bc-1.61a
2-3.73b
2-1.23c2；回归方程方差分析见表3。
[0077]
表3：回归方程方差分析
[0078][0079]
注：*显著(p《0.05)；**极显著(p《0.01)。
[0080]
由表3回归方程方差分析结果可知，回归模型f值较高，为13.81，p《0.01，说明此回归模型极为显著，具有统计学意义；方程的失拟项p值为0.4202》0.05，不显著，表明该回归模型拟合程度较高，无失拟因素存在；确定系数r2＝0.9467》0.80，校正确定系数r
2adj
＝0.8781，与r2接近，进一步说明模型的拟合程度较高，预测值与实际值具有较高的相似度；变异系数cv为2.78％，小于10％，说明实验结果具有较高的精密度和可靠性。综上所述，该回归模型拟合度高，误差小，可信度高，可以用于酶解耦合超声辅助低共熔溶剂提取香榧假种皮多酚的工艺条件的优化。
[0081]
回归模型方程中的一次项提取料液比(b)的影响极为显著，des摩尔比二次项(a2)、提取料液比二次项(b2)的影响极为显著，纤维素酶占比二次项(c2)的影响显著，二次项des摩尔比和提取料液比交互项(ab)、des摩尔比和纤维素酶占比交互项(ac)的影响不显著，二次项提取料液比和纤维素酶占比交互项(bc)的影响显著。由各因素f值大小可知，3个
因素对香榧假种皮多酚提取液总酚含量的影响程度次序为提取料液比(b)》des摩尔比(a)》纤维素酶占比(c)。
[0082]
4根据步骤3所得回归模型，应用统计学软件design-expert 12.0对提取工艺进一步优化，如图1-3所示，得到超声辅助低共熔溶剂提取香榧假种皮多酚的最佳工艺条件为：des摩尔比1:5.16194、提取料液比1:71.9539g/ml、纤维素酶和果胶酶液中纤维素酶占比56.84％，香榧假种皮多酚提取液总酚含量预测值为36.3175mg/g(香榧假种皮粉干重)。考虑实际操作，将以上条件调整为des摩尔比1:5.2、提取料液比1:72g/ml、纤维素酶和果胶酶液中纤维素酶占比57％，在此条件下进行三次验证试验，测得香榧假种皮提取液总酚含量的平均值为36.35mg/g(香榧假种皮粉干重)，与理论预测值相差不大，且该数值比优化前的数值提高了241％，说明box-behnken设计-响应面法优化后的酶解耦合超声辅助低共熔溶剂提取香榧假种皮多酚工艺可行，可推广于产业应用。
技术特征：behnken设计-响应面法设计三因素三水平的响应面分析试验；应用统计学软件design-expert 12.0对上述响应面试验设计数据进行回归拟合分析，得到香榧假种皮提取液总酚含量(y)的二次多项回归方程预测模型y＝36.13+0.5869a+1.32b-0.1852c-0.2510ab+0.1003ac-1.11bc-1.61a
2-3.73b
2-1.23c2；应用统计学软件design-expert 12.0对提取工艺进行优化，得到最佳提取工艺条件，并根据所得最佳提取工艺进行验证试验；最佳提取工艺条件为：低共熔溶剂中氢键受体和氢键供体的摩尔比1:5.16157、提取料液比1:71.9566g/ml、总酶液中纤维素酶液占比56.87％；香榧假种皮多酚提取液总酚含量预测值为36.3175mg/g。
技术总结本发明公开了一种酶解耦合超声辅助低共熔溶剂提取香榧假种皮中多酚类化合物的方法，本发明利用酶解法、超声辅助法和低共熔溶剂相结合的方式提取香榧假种皮中多酚类化合物，并对工艺进行优化，此方法提取的多酚类化合物与常规提取法相比含量提高了447％；本发明多酚类化合物的提取率高，且方法新颖、高效、绿色环保，避免了有机溶剂的大量使用，能够有效缓解环境污染问题，为天然产物中活性成分的提取提供了新的思路。供了新的思路。
技术研发人员：杨胜利 徐晓倩 徐德 王逸峰 王伟 刘兴泉 程勇 胡文迪 张慧
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2022.06.13
技术公布日：2022/11/1
