本发明涉及医药生物，尤其涉及一种靶向沉默alix基因表达的shrna、慢病毒表达载体和应用。
背景技术：
1、胃癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率在全球范围的恶性肿瘤中居第五位，死亡率极高。根据国际癌症研究机构(iarc)2020年统计数据，我国胃癌发病人数和死亡人数分别占全球的44％和48.6％，因此，胃癌的防治是我国恶性肿瘤防控面临的巨大挑战。
2、大量的研究数据表明，胃癌的临床治疗效果与其诊断的早晚有着密不可分的关系，早期胃癌在积极治疗的前提下是可以达到治愈的，若是进展期或者是晚期胃癌，五年生存率则会大幅度降低。现阶段对于胃癌的治疗，主要是内镜手术治疗和药物治疗。但由于中国常规性胃癌早筛尚未大范围开展，早期诊断率低，侵入性强，扩散快，且应用于临床治疗的相关药物诊断治疗效果不佳。因此，新的靶向标志物的发现与应用对于胃癌的诊疗至关重要。
3、程序性细胞死亡6相互作用蛋白(pdcd6ip)，也称alg2相互作用蛋白x(alix)，是近些年来研究较为深入的多功能胞质和多域支架蛋白之一。alix在细胞内普遍表达，在内体途径、病毒出芽、细胞骨架动力学、细胞增殖和凋亡中发挥着一系列重要功能。研究证明alix在前列腺癌细胞系的外泌体较非癌性前列腺细胞系的外泌体中有大量富集；alix可以通过控制表皮生长因子受体(egfr)活性和程序性死亡配体(pd-l1)呈递来调节肿瘤介导的免疫抑制并且与胰腺癌的tnm分期和转移密切相关。然而alix在胃癌中的研究甚少，因此，探究其发挥的作用对胃癌的早期诊断和治疗具有重要意义。
4、rna干扰(rna interference，rnai)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，是一种依赖于双链rna特异性短序列实现转录后的基因沉默的技术。它是指当细胞中导入与内源性mrna编码区同源的双链rna(double stranded rna，dsrna)时，该mrna发生降解而导致基因表达沉默的现象。外源dsrna进入细胞后产生的小分子干扰rna(smallinterfering rna，sirna)的反向链和多种核酸酶形成了沉默复合物(rna-inducedsilencing complex，risc)。risc具有结合和切割mrna的作用而介导rna干扰的过程。目前实验室常用的rnai技术主要有sirna寡核苷酸载体与shrna慢病毒质粒表达载体。短发夹核糖核酸(shrna)可以通过病毒介导的转染保持稳定，能够减少脱靶效应。rnai具有特异性和高效性。这种技术已经成为研究基因功能的重要工具，并将在病毒病、遗传性疾病和肿瘤病的治疗方面发挥重要作用。
5、shrna首先被插入到慢病毒载体上形成重组慢病毒质粒，慢病毒质粒与其他辅助质粒借助于293t细胞形成慢病毒，最终用慢病毒转染细胞发挥shrna的沉默作用。在内切核酸酶的作用下，shrna被裂解成核苷酸链，由正向链和反向链组成。反向链与特定的酶结合形成由rna诱导的沉默复合物risc(risc复合物中含sirna、核酸外切酶、核酸内切酶以及解旋酶等元件)，核苷酸双链会被活化后的risc解聚成为两条单链，随后反向链识别并结合与其同源的靶mrna，在反向链的引导下活化型risc会切割靶mrna的特定位置，同时切割的mrna会被risc复合物中的酶特异性降解，从而阻断mrna的遗传信息传递。
6、针对癌症细胞相关基因设计的靶向药物已逐渐应用于临床。但目前还未有利用shrna技术特异性针对胃癌细胞alix基因设计的shrna，鉴于此，特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明提供了一种靶向沉默alix基因表达的shrna、慢病毒表达载体和应用，设计的shrna分子通过慢病毒载体包装成慢病毒后感染人胃癌细胞、单核细胞，能与alix基因的mrna结合，高效地干扰其转录和翻译，降低alix基因在胃癌细胞、单核细胞中的表达，抑制细胞的迁移；著抑制胃癌细胞mgc803、单核细胞thp-1的生长速率，对胃癌的治疗具有十分重要的意义，解决了现有技术中存在的问题。
2、本发明提供了以下技术方案之一：
3、一种靶向沉默alix基因表达的shrna，所述shrna包括shalix-1和/或shalix-2；所述shalix-1的靶位点核苷酸序列如seq id no.1所示，所述shalix-2的靶位点核苷酸序列如seq id no.2所示。经筛选实验发现，该shrna可有效抑制alix基因的表达。
4、进一步地，制备所述shalix-1的正向链序列如seq id no.3所示，反向链序列如seq id no.4所示。
5、进一步地，制备所述shalix-2的正向链序列如seq id no.5所示，反向链序列如seq id no.6所示。
6、本发明提供了以下技术方案之二：
7、一种包含如上所述的shrna的慢病毒表达载体。
8、进一步地，所述慢病毒表达载体由shalix-1和/或shalix-2克隆到慢病毒表达载体中得到。慢病毒表达载体可以为plko.1。
9、如上所述的慢病毒表达载体的构建方法，包括如下操作步骤：
10、s1、采用引物退火合成shalix-1序列和/或shalix-2序列；
11、s2、将合成的shalix-1和/或shalix-2序列克隆到慢病毒表达载体中。
12、进一步地，上述构建方法还包括以下步骤：
13、将构建得到的表达靶向沉默alix的shrna的慢病毒表达载体转入大肠杆菌感受态细胞，接种到含氨苄青霉素(amp)的lb液体培养基过夜，得到细菌沉淀后加入内切核糖核酸酶进行酶切，将酶切的阳性质粒进行测序验证。
14、本发明提供了以下技术方案之三：
15、上述shrna在制备抑制alix基因表达的药物方面的应用。
16、上述shrna在制备用于治疗/预防胃癌相关的生物制剂中的应用。
17、本发明还提供了以下技术方案之四：
18、一种用于治疗胃癌的制剂，包含如前所述的靶向沉默alix基因表达的shrna。
19、进一步地，所述用于治疗胃癌的制剂还包括药学上可接受的载体或辅料、稀释剂或赋形剂。
20、上述“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助制剂的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
21、进一步地，上述制剂的剂型可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂。
22、本发明还提供了以下技术方案之五：
23、一种被靶向沉默的alix基因，其靶点序列如seq id no.1或seq id no.2所示。
24、本发明的有益效果：
25、1、本发明基于alix基因的mrna序列设计合成shrna分子，并构建shrna的寡核苷酸序列，其中得到的如seq id no.1、seq id no.2的两对shrna序列，通过慢病毒载体包装成慢病毒后感染人胃癌细胞、单核巨噬细胞，能够与alix基因的mrna结合，高效地干扰其转录和翻译，降低alix基因在胃癌细胞、单核巨噬细胞中的表达，抑制细胞的迁移，表现出明显的效果。
26、2、本发明设计的以上shrna序列能显著抑制胃癌细胞mgc803的生长速率，对胃癌的治疗具有十分重要的意义。为以alix相关制剂为核心的胃癌治疗新策略提供理论基础，有望应用于制备高效、特异性强、副作用小的抗癌基因药物，尤其针对胃癌基因药物制剂的研发，具有巨大的社会和经济效益。
1.一种靶向沉默alix基因表达的shrna，其特征在于，所述shrna包括shalix-1和/或shalix-2；所述shalix-1的靶位点核苷酸序列如seq id no.1所示，所述shalix-2的靶位点核苷酸序列如seq id no.2所示。
2.根据权利要求1所述的靶向沉默alix基因表达的shrna，其特征在于，制备所述shalix-1的正向链序列如seq id no.3所示，反向链序列如seq id no.4所示。
3.根据权利要求1所述的靶向沉默alix基因表达的shrna，其特征在于，制备所述shalix-2的正向链序列如seq id no.5所示，反向链序列如seq id no.6所示。
4.一种包含如权利要求1-3任一项所述的shrna的慢病毒表达载体。
5.根据权利要求4所述的慢病毒表达载体，其特征在于，所述慢病毒表达载体由shalix-1和/或shalix-2克隆到慢病毒表达载体中得到。
6.根据权利要求1-3任一项所述的shrna在制备抑制alix基因表达的药物方面的应用。
7.根据权利要求1-3任一项所述的shrna在制备用于治疗/预防胃癌相关的生物制剂中的应用。
8.一种用于治疗胃癌的制剂，其特征在于，包含如权利要求1-3中任一项所述的靶向沉默alix基因表达的shrna。
9.一种被靶向沉默的alix基因，其特征在于，其靶点序列如seq id no.1或seq idno.2所示。
