本公开大体涉及包含修饰核苷的寡核苷酸领域，诸如能够结合靶标分子的适配体。在一些实施方案中，本发明涉及包含超过一种类型的碱基修饰核苷的寡核苷酸，诸如适配体，以及制备和使用所述适配体的方法。
背景技术：
0、发明背景
1、修饰核苷已用作治疗剂、诊断剂并用于并入至寡核苷酸中以改进其特性(例如稳定性)。
2、selex(用于指数富集的配体系统进化)为用于鉴别选择性地结合靶标分子的寡核苷酸(称作适配体)的方法。所述selex方法描述于例如美国专利第5,270,163号中。所述selex方法涉及从寡核苷酸的随机混合物中选择和鉴别寡核苷酸以实际上实现结合亲和力和选择性的任何所需标准。通过将特定类型的修饰核苷引入至在所述selex方法的过程中鉴别的寡核苷酸中，可改变核酸酶稳定性、静电荷、亲水性或亲脂性以提供寡核苷酸的三维结构和靶标结合能力的差异。
技术实现思路
1、在一些实施方案中，提供包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶的适配体，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶不同。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。在某些实施方案中，所述部分通过接头共价连接至碱基的5位，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷选自napdc、2napdc、tyrdc和ppdc。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为ppdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第二5位修饰嘧啶为tyrdu。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过kod dna聚合酶并入。
2、在一些实施方案中，所述适配体结合选自pcsk9、psma、erbb1、erbb2、fxn、kdm2a、igf1r、pigf1r、a1-抗胰蛋白酶、cd99、mmp28和ppib的靶标蛋白。
3、在一些实施方案中，所述适配体在所述适配体的5’末端处包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度的区域，其中在所述适配体的5’末端处的所述区域缺乏5位修饰嘧啶。在一些实施方案中，所述适配体在所述适配体的3’末端处包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度的区域，其中在所述适配体的3’末端处的所述区域缺乏5位修饰嘧啶。在一些实施方案中，所述适配体为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。
4、在一些实施方案中，与具有相同长度和包含替代第一5位修饰嘧啶中每一者的未修饰嘧啶和/或替代第二5位修饰嘧啶中每一者的未修饰嘧啶的核碱基序列的适配体相比，所述适配体具有改进的核酸酶稳定性。在一些实施方案中，与具有相同长度和包含替代第一5位修饰嘧啶中每一者的未修饰嘧啶或替代第二5位修饰嘧啶中每一者的未修饰嘧啶的核碱基序列的适配体相比，所述适配体在人类血清中具有更长半衰期。
5、在一些实施方案中，提供一种包含多种多核苷酸的组合物，其中各多核苷酸包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶不同。在一些实施方案中，各多核苷酸在所述多核苷酸的5’末端处包含固定区域。在一些实施方案中，在各多核苷酸的5’末端处的固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。在一些实施方案中，各多核苷酸在所述多核苷酸的3’末端处包含固定区域。在一些实施方案中，在所述多核苷酸的3’末端处的固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、色胺酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。在某些实施方案中，所述部分通过接头共价连接至碱基的5位，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷选自napdc、2napdc、tyrdc和ppdc。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷选自napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为ppdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、trydu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第二5位修饰嘧啶为tyrdu。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过kod dna聚合酶并入。
6、在一些实施方案中，所述组合物的各多核苷酸包含无规区域。在一些实施方案中，所述无规区域为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或20至40个、或30至100个、或30至90个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或30至40个核苷酸长度。在一些实施方案中，各多核苷酸为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。
7、在一些实施方案中，提供一种组合物，其包含第一适配体、第二适配体和靶标，其中所述第一适配体包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶，其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶或其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶和至少一种第四5位修饰嘧啶；其中所述第一适配体、所述第二适配体和所述靶标能够形成三聚体复合物；并且其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。
8、在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。在某些实施方案中，所述部分通过接头共价连接至碱基的5位，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷选自napdc、2napdc、tyrdc和ppdc。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为ppdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第二5位修饰嘧啶为tyrdu。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过kod dna聚合酶并入。
9、在一些实施方案中，所述第三5位修饰嘧啶选自5位修饰胞嘧啶核苷和5位修饰嘧啶。在一些实施方案中，所述第三5位修饰嘧啶和所述第四5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。在一些实施方案中，第三5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且第四5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，第三5位修饰胞嘧啶核苷选自bndc、pedc、ppdc、napdc、2napdc、nedc、2nedc和tyrdc。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷选自bndu、napdu、pedu、ibdu、fbndu、2napdu、nedu、mbndu、bfdu、btdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。
10、在一些实施方案中，所述靶标选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。
11、在一些实施方案中，提供一种方法，其包括：
12、(a)使能够结合靶标分子的适配体与样品接触；
13、(b)用所述样品孵育所述适配体以允许适配体-靶标复合物形成；
14、(c)在所述样品中富集所述适配体-靶标复合物，以及
15、(c)检测所述适配体、所述适配体-靶标复合物或所述靶标分子的存在，其中所述适配体、所述适配体-靶标复合物或所述靶标分子的所述检测指示所述靶标分子存在于所述样品中，并且其中所述适配体、所述适配体-靶标复合物或所述靶标分子的检测的缺乏指示所述靶标分子不存在于所述样品中；
16、其中所述适配体为本文所提供的双重修饰适配体。在一些实施方案中，所述方法包括至少一个选自以下的额外步骤：将竞争分子添加至所述样品中；在固体支撑物上捕捉所述适配体-靶标复合物；以及添加竞争分子并稀释所述样品；其中所述至少一个额外步骤发生于步骤(a)或步骤(b)之后。在一些实施方案中，所述竞争分子选自聚阴离子竞争剂。在一些实施方案中，所述聚阴离子竞争剂选自寡核苷酸、葡聚糖、dna、肝素和dntp。在一些实施方案中，葡聚糖为硫酸葡聚糖；并且dna为鲱精dna或鲑鱼精dna。在一些实施方案中，所述靶标分子选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。在一些实施方案中，所述样品选自全血、白血球、外周血单核细胞、血浆、血清、唾液、呼吸、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸液、支气管抽吸液、滑液、关节抽吸液、细胞、细胞提取物、粪便、组织、组织活检物和脑脊髓液。
17、在一些实施方案中，提供一种用于检测样品中的靶标的方法，所述方法包括
18、a)使所述样品与第一适配体接触以形成混合物，其中所述第一适配体能够结合所述靶标以形成第一复合物；
19、b)在允许所述第一复合物形成的条件下孵育所述混合物；
20、c)使所述混合物与第二适配体接触，其中所述第二适配体能够结合所述第一复合物以形成第二复合物；
21、d)在允许所述第二复合物形成的条件下孵育所述混合物；
22、e)检测所述混合物中第一适配体、第二适配体、靶标、第一复合物或第二复合物的存在或不存在，其中第一适配体、第二适配体、靶标、第一复合物或第二复合物的存在指示所述靶标存在于所述样品中；
23、其中所述第一适配体包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶；
24、其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶，或其中所述第二适配体包含至少一种第三5位修饰嘧啶和至少一种第四5位修饰嘧啶；
25、其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。
26、在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。在某些实施方案中，所述部分通过接头共价连接至碱基的5位，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷选自napdc、2napdc、tyrdc和ppdc。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为ppdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第二5位修饰嘧啶为tyrdu。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过kod dna聚合酶并入。
27、在一些实施方案中，所述第三5位修饰嘧啶选自5位修饰胞嘧啶核苷和5位修饰嘧啶。在一些实施方案中，所述第三5位修饰嘧啶和所述第四5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。在一些实施方案中，第三5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且第四5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，第三5位修饰胞嘧啶核苷选自bndc、pedc、ppdc、napdc、2napdc、nedc、2nedc和tyrdc。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷选自bndu、napdu、pedu、ibdu、fbndu、2napdu、nedu、mbndu、bfdu、btdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。
28、在一些实施方案中，所述靶标分子选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。在一些实施方案中，所述第一适配体、所述第二适配体和所述靶标能够形成三聚体复合物。
29、在一些实施方案中，提供一种用于鉴别一种或多种能够结合靶标分子的适配体的方法，所述方法包括：
30、(a)使适配体的文库与所述靶标分子接触以形成混合物，并且允许形成适配体-靶标复合物，其中当适配体对所述靶标分子具有亲和力时，所述适配体-靶标复合物形成；
31、(b)从所述混合物的剩余部分分配所述适配体-靶标复合物(或富集所述适配体-靶标复合物)；
32、(c)解离所述适配体-靶标复合物；以及
33、(d)鉴别一种或多种能够结合靶标分子的适配体；
34、其中所述适配体的文库包含多种多核苷酸，其中各多核苷酸包含至少一种第一5位修饰嘧啶和至少一种第二5位修饰嘧啶，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶。在一些实施方案中，步骤(a)、(b)和/或(c)重复至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次。
35、在一些实施方案中，使所述一种或多种能够结合靶标分子的适配体扩增。在一些实施方案中，所述混合物包含聚阴离子竞争分子。在一些实施方案中，所述聚阴离子竞争剂选自寡核苷酸、葡聚糖、dna、肝素和dntp。在一些实施方案中，葡聚糖为硫酸葡聚糖；并且dna为鲱精dna或鲑鱼精dna。
36、在一些实施方案中，所述靶标分子选自蛋白、肽、碳水化合物、小分子、细胞和组织。
37、在一些实施方案中，各多核苷酸在所述多核苷酸的5’末端处包含固定区域。在一些实施方案中，在各多核苷酸的5’末端处的固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。在一些实施方案中，各多核苷酸在所述多核苷酸的3’末端处包含固定区域。在一些实施方案中，在所述多核苷酸的3’末端处的固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。
38、在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶为5位修饰胞嘧啶核苷并且其中所述第二5位修饰嘧啶为5位修饰尿嘧啶核苷。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分和吗啉代部分的部分。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷包含在5位的选自萘基部分、苯甲基部分、酪氨酰基部分和吗啉代部分的部分。在某些实施方案中，所述部分通过接头共价连接至碱基的5位，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。在一些实施方案中，所述5位修饰胞嘧啶核苷选自napdc、2napdc、tyrdc和ppdc。在一些实施方案中，所述5位修饰尿嘧啶核苷选自napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、trydu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第一5位修饰嘧啶为ppdc并且所述至少一种第二5位修饰嘧啶选自napdu、2napdu、ppdu、moedu、tyrdu、trpdu和thrdu。在一些实施方案中，所述至少一种第二5位修饰嘧啶为tyrdu。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。在一些实施方案中，所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过kod dna聚合酶并入。
39、在一些实施方案中，各多核苷酸包含无规区域。在一些实施方案中，所述无规区域为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或20至40个、或30至100个、或30至90个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或30至40个核苷酸长度。在一些实施方案中，各多核苷酸为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。
40、在一些实施方案中，各多核苷酸为结合靶标的适配体，并且其中所述文库包含至少1000种适配体，其中各适配体包含不同核苷酸序列。
41、在一些实施方案中，提供结合pcsk9蛋白的适配体。在一些所述实施方案中，所述适配体包含序列5’-ygpppg-3’，其中各y为tyrdu并且各p为napdc。在一些实施方案中，所述适配体还包含序列5’-yeayganpap-3’，其中e选自y、a和g；并且n为0或1。在一些实施方案中，n为0。在一些实施方案中，序列5’-yeayganpap-3’位于序列5’-ygpppg-3’的5’。在一些实施方案中，e为y。
42、在一些实施方案中，提供结合pcsk9的适配体，其中所述适配体包含序列5’-fnpppaagrjrprppwm-3’(seq id no:81)，其中f选自r和g；各r独立地选自g和a；j选自r和a；w选自r、g和a；n为0或1；m为0或1；r为ppdc；并且p为napdu。在一些实施方案中，m为1。在一些实施方案中，f为r。在一些实施方案中，j为r。在一些实施方案中，w为g。
43、在一些实施方案中，提供一种结合pcsk9的适配体，其中所述适配体包含序列5’-ttppggpp-3’，其中各p为napdc。
44、在一些实施方案中，结合pcsk9的适配体为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。
45、在一些实施方案中，所述适配体抑制pcsk9结合ldl-r。在一些实施方案中，所述适配体抑制pcsk9结合ldl-r，其中ic50小于30nm、小于20nm或小于15nm。
46、在一些实施方案中，提供一种降低受试者中的胆固醇的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用结合pcsk9的适配体。在一些实施方案中，结合pcsk9的适配体为本文所提供的适配体。在一些实施方案中，所述胆固醇为低密度脂蛋白(ldl)胆固醇(ldl-c)。在一些实施方案中，所述受试者患有杂合家族性高胆固醇血症或临床动脉粥样硬化性心血管疾病(cvd)。
47、本发明的前述内容和其他目标、特征和优势将由以下实施方式变得更明显，所述实施方式参考附图继续进行。
1.一种包含第一5位修饰嘧啶和第二5位修饰嘧啶的适配体，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶；
2.如权利要求1所述的适配体，其中所述5位修饰尿嘧啶的所述部分通过接头共价连接，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。
3.如权利要求1或权利要求2所述的适配体，其中所述5位修饰胞嘧啶的所述部分通过接头共价连接，所述接头包含所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。
4.如权利要求1或权利要求2所述的适配体，其中所述5位修饰胞嘧啶为5-(n-1-萘基甲基甲酰胺)-2'-去氧胞嘧啶核苷(napdc)。
5.如权利要求1或权利要求2所述的适配体，其中所述5位修饰尿嘧啶是5-(n-3-苯基丙基甲酰胺)-2'-去氧尿嘧啶核苷(ppdu)。
6.如权利要求1所述的适配体，其中所述第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述第二5位修饰嘧啶是ppdu。
7.如权利要求1、权利要求2或权利要求6所述的适配体，其中所述适配体在所述适配体的5’末端处包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度的区域，其中在所述适配体的5’末端处的所述区域缺乏5位修饰嘧啶。
8.如权利要求1、权利要求2或权利要求6所述的适配体，其中所述适配体在所述适配体的3’末端处包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度的区域，其中在所述适配体的3’末端处的所述区域缺乏5位修饰嘧啶。
9.如权利要求1、权利要求2或权利要求6所述的适配体，其中所述适配体为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。
10.一种包含多种多核苷酸的组合物，其中各多核苷酸包含第一5位修饰嘧啶和第二5位修饰嘧啶，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶为不同的5位修饰嘧啶；
11.如权利要求10所述的组合物，其中各多核苷酸在所述多核苷酸的5’末端处包含固定区域。
12.如权利要求11所述的组合物，其中在各多核苷酸的5’末端处的所述固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长，或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。
13.如权利要求10至12中任一项所述的组合物，其中各多核苷酸在所述多核苷酸的3’末端处包含固定区域。
14.如权利要求13所述的组合物，其中在所述多核苷酸的3’末端处的所述固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长度、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。
15.如权利要求10至12，或权利要求14中任一项所述的组合物，其中所述5位修饰尿嘧啶的所述部分通过接头共价连接，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。
16.如权利要求10至12，或权利要求14中任一项所述的组合物，其中所述5位修饰胞嘧啶的所述部分通过接头共价连接，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。
17.如权利要求10至12，或权利要求14中任一项所述的组合物，其中所述5位修饰胞嘧啶是napdc。
18.如权利要求10至12，或权利要求14中任一项所述的组合物，其中所述5位修饰尿嘧啶是ppdu。
19.如权利要求10至12，或权利要求14中任一项所述的组合物，其中所述第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述第二5位修饰嘧啶是ppdu。
20.如权利要求10至12，或权利要求14中任一项所述的组合物，其中各多核苷酸包含无规区域。
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述无规区域为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或20至40个、或30至100个、或30至90个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或30至40个核苷酸长度。
22.如权利要求10至12，权利要求14或权利要求21中任一项所述的组合物，其中各多核苷酸为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。
23.一种包含适配体和靶标的组合物，其中所述适配体和所述靶标能够形成复合物，并且其中所述适配体为如权利要求1至9中任一项所述的适配体。
24.一种包含第一适配体、第二适配体和靶标的组合物，
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述靶标选自蛋白、细胞和组织。
26.一种方法，其包括：
27.如权利要求26所述的方法，其中所述方法包括选自以下的额外步骤：将竞争分子添加至所述样品中；在固体支撑物上捕捉所述适配体-靶标复合物；以及添加竞争分子并稀释所述样品；其中所述额外步骤发生于步骤(a)或步骤(b)之后。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述竞争分子选自聚阴离子竞争剂。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述聚阴离子竞争剂选自寡核苷酸、葡聚糖、dna、肝素和dntp。
30.如权利要求29所述的方法，其中葡聚糖为硫酸葡聚糖；并且dna为鲱精dna或鲑鱼精dna。
31.如权利要求26至30中任一项所述的方法，其中所述靶标分子选自蛋白、细胞和组织。
32.如权利要求26至30中任一项所述的方法，其中所述样品选自全血、白血球、外周血单核细胞、血浆、血清、痰、呼出的气体、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸液、支气管抽吸液、滑液、关节抽吸液、细胞提取物、粪便、组织、组织活检物和脑脊髓液。
33.如权利要求26至30中任一项所述的方法，其中所述样品为细胞。
34.一种用于检测样品中的靶标的方法，其包括
35.如权利要求34所述的方法，其中所述靶标分子选自蛋白、细胞和组织。
36.如权利要求34或权利要求35所述的方法，其中所述第一适配体、所述第二适配体和所述靶标能够形成三聚体复合物。
37.一种用于鉴别一种或多种能够结合靶标分子的适配体的方法，所述方法包括：
38.如权利要求37所述的方法，其中各多核苷酸在所述多核苷酸的5’末端处包含固定区域。
39.如权利要求38所述的方法，其中在各多核苷酸的5’末端处的所述固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长，或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。
40.如权利要求37至39中任一项所述的方法，其中各多核苷酸在所述多核苷酸的3’末端处包含固定区域。
41.如权利要求40所述的方法，其中在所述多核苷酸的3’末端处的所述固定区域为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸长、或5至30个、10至30个、15至30个、5至20个或10至20个核苷酸长度。
42.如权利要求37至39或权利要求41中任一项所述的方法，其中所述5位修饰尿嘧啶的所述部分通过接头共价连接，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。
43.如权利要求37至39或权利要求41中任一项所述的方法，其中所述5位修饰胞嘧啶的所述部分通过接头共价连接，所述接头包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团。
44.如权利要求37至39或权利要求41中任一项所述的方法，其中所述5位修饰胞嘧啶是napdc。
45.如权利要求37至39或权利要求41中任一项所述的方法，其中所述5位修饰尿嘧啶是ppdu。
46.如权利要求37至39或权利要求41中任一项所述的方法，其中所述第一5位修饰嘧啶为napdc并且所述第二5位修饰嘧啶是ppdu。
47.如权利要求37至39或权利要求41中任一项所述的方法，其中各多核苷酸包含无规区域。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述无规区域为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或20至40个、或30至100个、或30至90个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或30至40个核苷酸长度。
49.如权利要求37至39，权利要求41或权利要求48中任一项所述的方法，其中各多核苷酸为20至100个、或20至90个、或20至80个、或20至70个、或20至60个、或20至50个、或30至100个、或30至90个、或30至80个、或30至70个、或30至60个、或30至50个、或40至100个、或40至90个、或40至80个、或40至70个、或40至60个、或40至50个核苷酸长度。
50.如权利要求37至39，权利要求41或权利要求48中任一项所述的方法，其中各多核苷酸为结合靶标的适配体，并且其中所述文库包含至少1000种适配体，其中各适配体包含不同核苷酸序列。
51.如权利要求37至39，权利要求41或权利要求48中任一项所述的方法，其中步骤(a)、(b)和/或(c)重复至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次。
52.如权利要求37至39，权利要求41或权利要求48中任一项所述的方法，其中所述一种或多种能够结合所述靶标分子的适配体被扩增。
53.如权利要求37至39，权利要求41或权利要求48中任一项所述的方法，其中所述混合物包含聚阴离子竞争分子。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述聚阴离子竞争剂选自寡核苷酸、葡聚糖、dna、肝素和dntp。
55.如权利要求54所述的方法，其中葡聚糖为硫酸葡聚糖；并且dna为鲱精dna或鲑鱼精dna。
56.如权利要求37至39，权利要求41，权利要求48，权利要求53至权利要求55中任一项所述的方法，其中所述靶标分子选自蛋白、细胞和组织。
57.如权利要求1至9中任一项所述的适配体，其中所述第一5位修饰嘧啶和所述第二5位修饰嘧啶能够通过聚合酶并入。
