本发明涉及植物基因工程，具体为一种增强植物内部活性物质的培育方法。
背景技术：
1、在现代生物技术领域，基因编辑技术的发展为植物育种带来了革命性的变革，传统的植物育种方法依赖于自然变异和选择，这一过程耗时长、效率低，且难以实现对特定性状的精确控制。化学诱变和辐射诱变虽然可以增加变异频率，但往往伴随着大量的非目标效应，增加了筛选的难度和不确定性。
2、此外，随着全球对健康和可持续发展的关注日益增加，对植物内部活性物质的需求也在不断增长。这些活性物质在医药、食品、化妆品等行业中具有广泛的应用价值。然而，通过传统育种方法提高植物内部活性物质的含量往往受限于植物自身的遗传变异和自然选择的局限性，因此，本领域的技术人员提供了一种增强植物内部活性物质的培育方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
技术实现思路
1、(一)解决的技术问题
2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种增强植物内部活性物质的培育方法，解决了传统育种方法提高植物内部活性物质的含量往往受限于植物自身的遗传变异和自然选择的局限性的问题。
3、(二)技术方案
4、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种增强植物内部活性物质的培育方法，其特征在于：包括：
5、选择目标植物并确定与活性物质合成相关的基因序列，选择具有经济价值或研究价值的植物作为研究对象，并通过文献调研、基因组数据库查询或实验研究，确定与目标活性物质合成相关的基因序列，这些基因可能涉及初级代谢途径、次级代谢途径或特定的生物合成途径；
6、设计并合成crispr/cas9基因编辑工具，根据已确定的基因序列，设计导向rna，使其能够精确识别并结合到目标基因的特定区域，然后，合成grna和cas9蛋白，或构建含有grna和cas9基因的载体，grna的设计需要高度特异性和亲和力，以确保编辑的精确性；
7、导入crispr/cas9基因编辑工具，采用农杆菌介导转化、基因枪轰击或电穿孔的方法将crispr/cas9基因编辑工具导入植物细胞，转化后，将植物细胞置于选择培养基中，筛选出成功转化的细胞；
8、筛选和鉴定基因编辑成功的植物细胞，并进行组织培养，从筛选出的转化细胞中，通过pcr、测序的分子生物学方法验证目标基因的编辑效率和特异性，确认基因编辑成功的细胞后，进行组织培养，诱导分化和再生，获得完整的转基因植物；
9、对转基因植物进行生长培养，并验证目标基因的编辑效果，将转基因植物在温室或田间中进行生长培养，通过分子生物学方法，进一步验证目标基因的编辑效果，同时通过生化分析方法，测定植物内部活性物质的含量和种类；
10、收获转基因植物并评估培育效果，在植物成熟后，收获转基因植物，并对植物内部活性物质进行提取和分析，通过比较转基因植物与野生型植物的活性物质含量和种类，评估基因编辑对活性物质含量的提升效果。
11、优选的，所述选择目标植物并确定与活性物质合成相关的基因序列包括以下步骤：
12、s1.确定目标活性物质，明确想要增强的植物内部活性物质的类型，可能是某种特定的次生代谢产物，了解这些活性物质的生物合成途径和生理功能对于后续的基因选择至关重要；
13、s2.文献调研和数据库查询，通过查阅相关文献和数据库，收集关于目标活性物质合成途径的信息，其中包括了解合成途径中的关键酶、调控因子以及它们在植物体内的表达模式；
14、s3.基因表达分析，利用转录组学技术对目标植物在不同生长阶段、不同组织或在特定环境条件下的基因表达模式进行分析，这有助于识别与活性物质合成密切相关的基因；
15、s4.基因功能验证，通过基因敲除、过表达或沉默的遗传操作，验证候选基因的功能，需要使用crispr/cas9基因编辑技术进行基因功能的验证；
16、s5.基因序列分析，对确定的与活性物质合成相关的基因进行序列分析，包括编码区和非编码区的分析，有助于设计特异性的导向rna，以实现精确的基因编辑；
17、s6.设计导向rna，根据目标基因的序列信息，设计特异性的导向rna，设计需要考虑基因组中特定的ram序列，以确保cas9蛋白能够准确识别并切割目标基因；
18、s7.验证rna的特异性和效率，在体外或通过植物细胞培养系统验证rna的特异性和切割效率，通过构建含有目标基因和rna的表达载体，并在体外进行cas9蛋白进行切割实验，或在植物细胞中进行基因编辑实验来完成。
19、优选的，所述设计并合成crispr/cas9基因编辑工具包括以下步骤：
20、s1.目标位点的选择，通常需要满足以下条件：位于目标基因的编码区或调控区；位点附近有适当的pam序列；位点具有较高的特异性，以减少非特异性编辑的风险；
21、s2.导向rna的设计，在设计时需要考虑以下因素：与目标位点互补的20个核苷酸序列；3'端的pam序列；避免二级结构的形成，以确保rna的活性；rna设计的算法公式为：
22、rna＝pam+20nt complementary sequence
23、其中，pam是特定于cas9变体的序列，20nt complementary sequence是与目标dna序列互补的20个核苷酸；
24、s3.导向rna的合成，rna的合成通常通过化学合成方法完成，合成的rna需要经过纯化和质量检测，以确保其活性和纯度；
25、s4.cas9蛋白的选择和准备，选择适合的cas9蛋白变体，例如spcas9、sacas9，根据目标植物的基因组特点和pam序列选择合适的cas9蛋白，cas9蛋白可以通过表达和纯化获得，也可以通过购买商业化得知重组cas9蛋白；
26、s5.组装和验证，将合成的rna与cas9蛋白组装crispr/cas9复合体，并通过体外切割实验验证其活性；
27、s6.转化和筛选，将crispr/cas9复合体导入目标植物细胞，通过筛选和鉴定，获得基因编辑成功的植物细胞；
28、s7.验证和分析，通过分子生物学方法验证目标基因的编辑效率和特异性。
29、优选的，所述导入crispr/cas9基因编辑工具包括以下步骤：
30、s1.导入方法的选择，具体可分为：农杆菌介导转化、基因枪轰击、电穿孔和化学介导转化，具体可根据实际使用选择；
31、s2.导入crispr/cas9组件，将crispr/cas9组件导入植物细胞，通常包括以下步骤：
32、s2.1.载体构建，将cas9和rna序列克隆到适合植物转化的载体中；
33、s2.2.转化，使用选定的方法将crispr/cas9载体导入植物细胞；
34、s2.3.筛选，通过抗生素筛选或分析标记筛选转化成功的细胞；
35、s3.算法公式，使用在线工具来评估rna的特异性和效率，这些工具会给出一个综合评分，帮助选择最佳的rna序列，确保rna设计中包含的pam序列与目标植物基因组中cas9蛋白的pam兼容性相匹配；
36、s4.转化效率和优化，调整转化过程中的关键参数，其中包括农杆菌的od值、共培养时间和抗生素浓度，选择易于转化的植物材料，如幼嫩的叶片和胚性愈伤组织；
37、s5.验证和筛选，通过pcr扩增目标区域，并进行测序验证，以确认cri spr/cas9系统是否成功编辑了目标基因，观察转化植物的表型变化，以评估基因编辑的效果；
38、s6.注意事项，确保实验过程符合生物安全规范，避免基因编辑植物的意外扩散，遵守相关伦理和法规，确保研究的合法性。
39、优选的，所述筛选和鉴定基因编辑成功的植物细胞，并进行组织培养包括以下步骤：
40、s1.筛选基因编辑植物细胞，如果cri spr/cas9载体包含抗生素性基因，则将转化后的植物细胞置于含有相应抗生素的选择培养基中；
41、s2.鉴定基因编辑植物细胞，使用特异性引物对目标基因进行pcr扩增，然后通过凝胶电泳分析pcr产物，对pcr产物进行测序，以确认基因编辑位点的序列变化，使用southern blot等分子杂交技术进一步验证基因编辑事件；
42、s3.组织培养，将筛选和鉴定成功的植物细胞转移到愈伤组织诱导培养基上，以促进细胞分裂和愈伤组织的形成，将愈伤组织转移到分化培养基上，以诱导愈伤组织分化成植物体的各个部分，如根、茎和叶，将分化出的植物体转移到生根培养基上，以促进根的形成，完成植物体的再生；
43、s4.硬化和移栽，将再生的植物体在温室条件下进行硬化处理，以适应自然环境，将硬化后的植物体移栽到土壤中，进行进一步的生长和发育。
44、优选的，所述对转基因植物进行生长培养，并验证目标基因的编辑效果包括以下步骤：
45、s1.生长培养，根据植物种类和生长阶段，准备适合的生长培养基，这通常包括基本的营养成分，如氮、磷和钾，以及植物生长所需的微量元素和维生素，将转基因植物置于适宜的生长条件下，如温度、湿度和光照，对于温室培养，需要控制这些环境因素以模拟自然生长条件，定期监测植物的生长情况，包括生长速度、叶片颜色和根系发展；
46、s2.验证目标基因的编辑效果，分子生物学验证，使用特异性引物对目标基因进行pcr扩增，以检查基因编辑时间是否发生，将pcr产物进行凝胶电泳分析，以确定基因编辑是否导致了预期的dna片段大小变化，对pcr产物进行测序，以确认基因编辑位点的序列变化是否符合预期，使用qpcr定量分析目标基因的表达水平，以评估基因编辑对基因表达的影响；
47、生化分析验证，如果基因编辑影响了蛋白质的表达，可以通过western blot技术检测目标蛋白的表达水平，通过高效液相色谱技术测定植物内部活性物质的含量，以评估基因编辑对活性物质合成的影响；
48、s3.数据分析，对收集的数据进行统计分析，以确定基因编辑效果的显著性，根据分析生物学和生化分析的结果，解释基因编辑对植物生长和活性物质合成的影响。
49、优选的，所述收获转基因植物并评估培育效果包括以下步骤：
50、s1.收获转基因植物，根据实物的生长周期，确定转基因植物的成熟期，在成熟期，按照植物的特定部位进行收获；
51、s2.样品准备，将收获的植物材料进行适当的处理，其中包括清洗、干燥和研磨，以准备进行活性物质的提取和分析，将处理好的样品在适宜的条件下保存，以防止活性物质的降解或变化；
52、s3.提取活性物质，根据目标活性物质的化学性质，选择合适的提取方法，常用的提取方法包括溶剂提取、超声波提取和微波辅助提取，按照选定的方法进行活性物质的提取，并收集提取液；
53、s4.活性物质分析，选择合适的分析方法来测定活性物质的含量和种类，使用选定的分析方法对提取液中的活性物质进行定量和定性分析；
54、s5.数据分析与评估，对分析结果进行数据处理，包括计算活性物质的含量、比较不同样品之间的差异，进行统计分析，以确定活性物质含量的差异是否具有统计学意义，根据分析结果评估基因编辑对活性物质含量的影响，判断基因编辑是否成功提高了活性物质的含量；
55、s6.结果记录与报告，记录实验过程中的所有详细信息，包括样品处理、提取方法和分析条件，根据实验结果撰写详细的实验报告，包括实验设计、操作步骤、分析结果和结论。
56、(三)有益效果
57、本发明提供了一种增强植物内部活性物质的培育方法。具备以下有益效果：
58、1、本发明中，与传统的植物育种方法相比，cri spr/cas9技术可以显著缩短育种周期，提高育种效率，通过一次基因编辑操作，可以在较短时间内获得具有所需特性的植物，该技术可以针对特定的基因进行编辑，实现对植物特定活性物质含量的定向提升，而不会影响植物的其他性状。
59、2、本发明中，通过基因编辑技术提高植物内部活性物质含量的方法更加环保，减少了对化学物质的依赖和可能产生的环境污染，同时有助于培育出适应性更强、抗逆性更好的植物品种，有助实现农业生产的可持续发展。
1.一种增强植物内部活性物质的培育方法，其特征在于：包括：
2.根据权利要求1所述的一种增强植物内部活性物质的培育方法，其特征在于：所述选择目标植物并确定与活性物质合成相关的基因序列包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的一种增强植物内部活性物质的培育方法，其特征在于：所述设计并合成crispr/cas9基因编辑工具包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的一种增强植物内部活性物质的培育方法，其特征在于：所述导入crispr/cas9基因编辑工具包括以下步骤：
5.根据权利要求1所述的一种增强植物内部活性物质的培育方法，其特征在于：所述筛选和鉴定基因编辑成功的植物细胞，并进行组织培养包括以下步骤：
6.根据权利要求1所述的一种增强植物内部活性物质的培育方法，其特征在于：所述对转基因植物进行生长培养，并验证目标基因的编辑效果包括以下步骤：
7.根据权利要求1所述的一种增强植物内部活性物质的培育方法，其特征在于：所述收获转基因植物并评估培育效果包括以下步骤：
