本发明涉及生物医药，具体为hdac的抑制剂丙戊酸在rsv感染中的治疗方法。
背景技术：
1、人呼吸道合胞病毒(rsv)是一种负义rna病毒，属于副粘病毒科，是儿童流行性细支气管炎和肺炎的主要原因，由于目前没有有效的疫苗，这种无处不在的病毒感染与住院儿童中40-60％的毛细支气管炎病例和15-25％的肺炎病例有关，在世界范围内，婴儿严重的rsv感染与大量发病率相关，并且先前的研究结果表明，生命早期感染rsv会增加哮喘的风险，因此，预防rsv疾病非常重要。
2、除了直接的上皮损伤外，婴儿和免疫功能低下患者的rsv感染通常会引起严重的气道炎症，这涉及多种促炎介质的释放以及支气管周围和血管周围间隙的炎症细胞募集，以及粘液产生的增加；因此，抑制病毒复制和减少病毒诱导的气道炎症是严重rsv感染的合适治疗靶点。
3、蛋白质乙酰化是一种重要的表观遗传修饰模式，在宿主防御病毒感染中起着关键作用，组蛋白去乙酰化酶(hdac)是一种去除组蛋白上特定赖氨酸残基的乙酰基片段以调节染色质结构和基因表达的酶，这些酶也在翻译后修饰许多非组蛋白靶标，包括转录因子、伴侣和信号分子，导致蛋白质稳定性、蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质-dna相互作用的变化，以控制各种细胞功能，传统hdac家族由11个成员组成，它们需要zn2+作为脱乙酰酶活性的辅助因子，并根据其同源性分为四类。
4、hdac的小分子抑制剂，如trichostatin a(tsa)和suberoylanilide hydroxamicacid(saha)，已被研究用于潜在的抗癌药物，除了具有抗癌活性外，泛hdac抑制剂还具有有效的抗炎特性，其治疗感染性休克、类风湿关节炎、多发性硬化和哮喘的效果已被证实。hdac抑制剂已被发现具有抗病毒作用，如tsa和saha，减少丙型肝炎病毒(hcv)的复制。然而，据我们所知，hdac蛋白在调节副粘病毒感染，特别是rsv感染中的作用尚未被报道。vpa为一种广泛使用的抗癫痫药物，能够抑制hdac1的活性，同时诱导hdac2的降解。
5、我们发现丙戊酸(valproic acid，vpa)是一种具有口服活性的hdac抑制剂，能够抑制hdac1的活性，同时诱导hdac2的降解，vpa也作为一种hdac抑制剂已被用于治疗癫痫多年。sars-cov-2以及rsv在内的其他呼吸道病毒的感染通常会对受感染人群造成广泛的肺部损伤，而这种肺部损伤会造成部分康复患者被观察到的长期肺部异常(如肺纤维化)，为此提出hdac的抑制剂丙戊酸在rsv感染中的治疗方法。
技术实现思路
1、本发明的目的在于vpa通过表观遗传调控降低rsv病毒载量，调节免疫细胞和细胞因子对感染的反应，从而减轻病毒感染。
2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：hdac的抑制剂丙戊酸在rsv感染中的治疗方法，其方法包括以下步骤：
3、s1：细胞培养与rsv感染
4、人正常肺上皮细胞系beas-2b、pc9和hela由中南大学基础医学院微生物系所冻存和保留，rsv(long strain/a2 type)was stored by the department of medicalmicrobiology of central south university，在无菌条件下培养细胞，并在含有10％胎牛血清的dmem和1640培养基(37℃培养箱，5％co2)中培养；
5、s2：western blot检测vpa对hdac1/2和gimap7表达的影响
6、取细胞生长状态良好的beas-2b细胞铺于六孔板中；待细胞贴壁后，加入不同浓度的小分子化合物丙戊酸(0mm、0.5mm、1mm和2mm),分别作用24h后，提取细胞rna和细胞蛋白进行进一步实验；
7、s3：cck8检测vpa对beas-2b和pc9细胞毒性
8、细胞毒性试验采用cell counting kit-8检测，beas-2b在96孔细胞培养板的密度2×103个细胞，加入不同浓度的vpa(0mm、1mm、2mm、5mm、10mm和20mm)；
9、s4：rt-qpcr检测rsv,hdac1/2的表达以及rsv病毒dna载量
10、建立小分子化合物细胞组和dmso对照组，从hela的beas-2b细胞中制备总rna，并用smartspectmplus分光光度计进行定量，使用trizol试剂从肺组织中提取总rna，使用rr036a primescript rt master mix将每个样本逆转录为cdna，按照说明书使用2×sybrgreen qpcr master mix进行扩增；
11、s5：间接免疫荧光检测rsv的荧光信号
12、4％多聚甲醛固定和0.4％ triton-x100通透beas-2b细胞，肺组织切片在95％乙醇和0.1％triton-x100中通透，用正常山羊血清封闭20分钟，加入rsv主要表面糖蛋白g单克隆抗体兔一抗4℃孵育过夜，第二天，用pbst洗切片3次，每次4min，滴加稀释的山羊抗兔igg/cy3二抗，37℃孵育1h，再pbst浸洗3次，每次4min，滴加dapi后避光孵育5min(复染核)，最后pbst清洗切片5次，每次4min后封片在共聚焦激光扫描显微镜下对样品进行观察拍照；
13、s6：动物模型
14、准备18只、4-6周龄、雌性、balb/c小鼠，经随机手段把小鼠归入健康对照组、rsv感染组、丙戊酸药物干预组(400mg/kg)，各组动物都于标准条件下先对环境适应5-7d；异氟醚麻醉小鼠后，鼻内接种rsv 5×106pfu(100μl)；
15、s7：he染色
16、每只动物的肺组织在10％甲醛溶液中固定24小时，然后石蜡包埋，切成5μm薄片，按照常规实验程序进行苏木精-伊红染色，并在光学显微镜下观察组织形态学变化；
17、s8：酶联免疫吸附试验(elisa)
18、收集小鼠肺匀浆，使用elisa试剂盒测定il-1β、il-6和tnf-α水平，小鼠肺匀浆4℃1000rpm离心10min；
19、s9：统计学分析
20、借助excel，开展原始计数资料的整合与分析工作；借助image j，对一系列原始图片开展数字化处理工作，同时展示量化数据；借助graphpad prism8软件，针对原始计数资料和量化数据，开展处理分析工作；利用t检验，对符合正态分布的计量资料开展正态性分布检验，利用非参数检验，对不符合正态分布的计量资料开展正态性分布检验，以上分析结果利用均数±标准误(mean±sem)表示，当p＜0.05时，则具有统计学差异。
21、优选的，所述s1中待细胞密度达85％左右，加入不同浓度的化合物vpa并以1×104pfu左右的rsv感染细胞，待24h后检测rsv的病毒载量。
22、优选的，所述s3中按照cck-8试剂盒方案处理细胞，使用tecan f50测定每个孔在450nm处的分光光度吸收值。
23、优选的，所述s4中采用cfx96 touchtm深井实时荧光定量pcr检测系统，在热循环条件下使用tbex taq进行定量pcr(qpcr)。
24、优选的，所述s5中用pbst洗五次，每次4分钟，然后dapi染色5分钟，在共聚焦激光扫描显微镜下对样品进行观察拍照。
25、优选的，所述s6中对于模拟感染(对照组)，小鼠给予等量的无菌pbs，在rsv感染后2～4h灌胃小分子化合物vpa。
26、优选的，所述s8中收集上清液，使用tecan f50在450nm处测量od值。
27、优选的，所述s9中利用adobe photoshop 2021与graphpad prism 8软件，开展图片处理和绘图工作。
28、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
29、本发明的vpa是一种具有口服活性的hdac抑制剂，能够抑制hdac1的活性，同时可诱导hdac2的降解，但rsv通过增强hdac1/2表达来降低组蛋白乙酰化,进而抑制抗病毒蛋白gimap7的表达。在构建的体内体外的rsv感染模型中验证了vpa通过抑制hdac1/2而提高gimap7的表达，进而抑制rsv的能力，实验结果显示vpa能够不同程度的抑制rsv的感染和维持肺组织的正常生理结构，有抗rsv感染的实用价值。
1.hdac的抑制剂丙戊酸在rsv感染中的治疗方法，其特征在于：其方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的hdac的抑制剂丙戊酸在rsv感染中的治疗方法，其特征在于：所述s1中待细胞密度达85％左右，加入不同浓度的化合物丙戊酸并以1×104pfu左右的rsv感染细胞，待24h后检测rsv的病毒载量。
3.根据权利要求1所述的hdac的抑制剂丙戊酸在rsv感染中的治疗方法，其特征在于：所述s3中按照cck-8试剂盒方案处理细胞，使用tecan f50测定每个孔在450nm处的分光光度吸收值。
4.根据权利要求1所述的hdac的抑制剂丙戊酸在rsv感染中的治疗方法，其特征在于：所述s4中采用cfx96 touchtm深井实时荧光定量pcr检测系统，在热循环条件下使用tbex taq进行定量pcr(qpcr)。
5.根据权利要求1所述的hdac的抑制剂丙戊酸在rsv感染中的治疗方法，其特征在于：所述s5中用pbst洗五次，每次4分钟，然后dapi染色5分钟，在共聚焦激光扫描显微镜下对样品进行观察。
6.根据权利要求1所述的hdac的抑制剂丙戊酸在rsv感染中的治疗方法，其特征在于：所述s6中对于模拟感染(对照组)，小鼠给予等量的无菌pbs，在rsv感染后2～4h灌胃小分子化合物丙戊酸(vpa)。
7.根据权利要求1所述的hdac的抑制剂丙戊酸在rsv感染中的治疗方法，其特征在于：所述s8中收集上清液，使用tecan f50在450nm处测量od值。
8.根据权利要求1所述的hdac的抑制剂丙戊酸在rsv感染中的治疗方法，其特征在于：所述s9中利用adobe photoshop 2021与graphpad prism 8软件，开展图片处理和绘图工作。
