本发明涉及基因编辑，具体涉及利用crispr/cas9技术构建猪ybx3基因敲除细胞系。
背景技术：
1、猪流行性腹泻(ped)是由pedv引起的一种急性、高传染性的猪肠道疾病。其主要特征是水样腹泻、呕吐、脱水和厌食等症状。目前，全球养猪业仍然受到ped的威胁，ped仍然是最有害的传染病之一。现有的疫苗和抗病毒药物在预防新进化的pedv高致病性变种引起的感染方面存在局限性。这突出了提出有效预防和控制pedv发病和流行的新策略的必要性。
2、crispr/cas9系统是古细菌和细菌在长期演化过程中形成的适应性免疫防御系统。作为规律成簇间隔短回文重复系统，crispr/cas9是一种基因编辑工具，通过cas9核酸酶介导sgrna识别并切割dsdna，诱发由非同源末端连接修复机制造成的移码突变，从而实现对靶基因的编辑。由于该技术操作性强且效率高，近几年已经成为定点编辑的重要遗传手段，是最具有临床与应用前景的基因治疗技术之一。
3、ybx3是一种y-盒转录因子，对具有倒置ccaat盒的某些启动子序列具有选择性。ybx3在上皮细胞的增殖和分化中起着重要作用。目前技术中尚未见到与猪pedv抗病育种相关的ybx3基因敲除细胞系构建技术方案。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的问题，一方面，本发明提供了一种猪ybx3基因敲除细胞系的构建方法，包括以下步骤：
2、s1、通过在线软件网址设计sgrna向导序列，分别为sgrna1、sgrna2、sgrna3；
3、s2、在5’端添加额外碱基cacc，若sgrna5’端无碱基g，则额外添加碱基g，反向互补序列添加额外碱基aaac，退火后形成dsdna；退火后dsdna进行酶切，并连接至线性化pgk1.2载体，得到连接产物，后续进行pcr测序挑选阳性克隆并扩大培养，提取质粒得到阳性敲除质粒；
4、s3、阳性敲除质粒混合电转入ipec-j2细胞系并进行药筛，提取ybx3敲除细胞dna，使用t7 endonuclease i酶将pcr产物酶切，同时进行pcr的扩增测序，验证sgrna效率；
5、s4、选择转染高效率sgrna的ipec-j2进行有限稀释法筛选，挑选单克隆细胞，扩大培养后经pcr测序和western blot验证成功筛选得到ybx3基因敲除细胞系；
6、s5、ybx3敲除细胞系和对照组细胞提取rna，反转录后使用rt-qpcr检测pedv m基因的表达差异。
7、优选地，所述步骤s1中的在线软件网址为http://crispr.mit.edu/。
8、优选地，所述步骤s1中sgrna1、sgrna2、sgrna3的序列为：
9、sgrna1：ctcttgggcgcggggtcctg；
10、sgrna2：gagattggagaaatgaagga；
11、sgrna3：gaaatccgacttaccgccca。
12、另一方面，本发明提供一种猪ybx3基因敲除细胞系的构建方法在构建猪ybx3基因敲除细胞系中的应用。
13、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
14、1.本发明成功建立猪ybx3基因敲除的ipec-j2细胞系，crispr/cas9敲除技术比起干扰、基因沉默等技术手段更有效果，能够有助于研究ybx3在猪抗病育种中的功能；
15、2本发明的敲除技术方法简单，验证方法合理，通过设计sgrna即可对靶基因进行高效敲除，且pcr测序和western blot结果有效证实ybx3基因功能的缺失，是比较理想的ybx3基因敲除的ipec-j2细胞模型；
16、3.本发明提供了上述猪ybx3基因敲除细胞系在猪pedv的抗病育种中的应用。
1.一种猪ybx3基因敲除细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种猪ybx3基因敲除细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤s1中的在线软件网址为http://crispr.mit.edu/。
3.根据权利要求1所述的一种猪ybx3基因敲除细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤s1中sgrna1、sgrna2、sgrna3的序列为：
4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种猪ybx3基因敲除细胞系的构建方法在构建猪ybx3基因敲除细胞系中的应用。
