本发明属于微生物，具体涉及一种能高效合成庚七醇的解脂耶氏酵母菌株及其构建方法和应用。
背景技术：
1、功能性糖醇因其优异的功能特性和对人体健康的益处，在食品、医药、化工等领域得到了广泛的应用。糖醇具有与蔗糖相同或更好的甜味，但热值更低的特性，正逐渐成为食品配料。然而，天然存在的糖醇的量极少，限制了它们的应用。利用微生物全细胞催化剂生产功能性糖醇正在成为主要的替代方案。
2、解脂耶氏酵母（yarrowia lipolytica或candida lipolytica）是一种公认的食品安全微生物（yarrowia lipolytica: safety assessment of an oleaginous yeast witha great industrial potential，crit rev microbiol, 2014, 40(3): 187–206），能作为多种天然化合物的合成底盘或者宿主。由于解脂酵母y. lipolytica在糖酵解和ppp途径中高通量形成和积累糖醇生物合成的关键胞内中间体，因此，解脂酵母y. lipolytica已被广泛用于工业合成许多具有生物活性的天然糖醇(如赤藓糖醇、d-苏糖醇、甘露醇和木糖醇)（yarrowia lipolytica as an emerging biotechnological chassis for functionalsugars biosynthesis. crit rev food sci 2021, 61(4):535-552）。
3、附图1显示解脂酵母中糖酵解和磷酸戊糖途径(ppp)。高效合成赤藓糖醇的解脂酵母菌株y. lipolytica cgmcc no.7326是本发明实验室从蜂巢中分离得到（程海荣等，中国发明专利201310282059.x，解脂亚罗酵母菌株及其用于合成赤藓糖醇的方法）。在y.lipolytica cgmcc no.7326中，70%的葡萄糖通过糖酵解中间体6-磷酸葡萄糖 (g-6-p)转化为6-磷酸葡糖酸(gn-6-p)进入ppp途径，更多的葡萄糖通过转酮醇酶tkl1进入ppp途径，该酶将糖酵解中间体3-磷酸甘油醛 (ga-3-p)与6-磷酸果糖 (f-6-p)转化为5-磷酸木酮糖(xu-5-p)和4-磷酸赤藓糖(ery-4-p)。tkl1是所有生物体ppp途径中的关键酶，在ppp途径中tkl1可导致关键中间体7-磷酸景天庚酮糖（sep-7-p）的积累。tkl在糖酵解和ppp途径之间建立了联系，其中5-磷酸核酮糖（ru-5-p）、5-磷酸木酮糖（xu-5-p）、7-磷酸景天庚酮糖（sep-7-p）、4-磷酸赤藓糖（ery-4-p）等中间体可以还原为相应的糖醇。
4、庚七醇（volemitol）是一种天然存在的七碳（c7）糖醇，具有作为天然的甜味剂的潜力，广泛存在于自然界中（如高等植物、藻类、真菌和细菌）。牛油果的果实和种子、报春花的叶和根、景天的叶和茎、绿藻（trentepohlia umbrina）、褐藻（pelvetia canaliculata）、红藻（porphyra sp.）、地衣（parmotrema centratum）、叶苔（plagiochila asplenioides）和酵母（torulopsis versatilis）中检测到庚七醇（occurrence, metabolism, transportand function of seven-carbon sugars. phytochem rev 2017, 16(1):137-157；sugaralcohols (polyols) in fungi and green plants. i. distribution, physiology andmetabolism. the new phytologist 1967, 66(2):143-184）。
5、和其他糖醇一样，庚七醇起着重要的生理作用。庚七醇是一种稀有的七碳糖醇，存在于牛油果的种子和果实组织中。牛油果是一种稀有的果树，它能够合成和转运大量的c7糖和c7糖醇（甘露庚糖醇和庚七醇）作为非结构性碳水化合物的主要形式。牛油果以其高营养价值而闻名，这些七碳糖和七碳糖醇在牛油果中的作用被推测为果实成熟因子或在果实发育和成熟相关的代谢过程中作为抗氧化剂的前体（effect of cultivar on thecontent of selected phytochemicals in avocado peels. food res int 2021, 140:110024；the isolation of volemitol and other polyhydric alcohols from avocadoseeds. carbohyd res 1970, 12:135-138；metabolic control of avocado fruitgrowth: 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a reductase, active oxygenspecies and the role of c7 sugars. s afr j bot 2004, 70(1):75-82）。在园艺杂交植物多花报春（报春花 × 多花蔷薇）中，庚七醇是各发育阶段叶片中主要的水溶性非结构碳水化合物，报春花叶片中的庚七醇浓度与许多其他糖醇植物相似（高达50 mg/g鲜重，约为干重的25%），如此高的浓度表明庚七醇的主要作用是作为一种细胞内碳源储存物质（metabolism of d-glycero-d-manno-heptitol, volemitol, in polyanthus.discovery of a novel ketose reductase1. plant physiol 1999, 119(1):191-198）。庚七醇在多花报春中的主要生理功能，除了作为储存碳水化合物外，还涉及韧皮部转运、碳同化和金属离子的转运和再分配，以满足生长发育所必需的营养需求。庚七醇是一种重要的韧皮部流动碳水化合物，约占多花报春韧皮部汁液碳水化合物的24% (mol/mol)（metabolism of d-glycero-d-manno-heptitol, volemitol, in polyanthus.discovery of a novel ketose reductase1. plant physiol 1999, 119(1):191-198）。在报春花的成熟源叶光合作用的碳同化过程中，14co2对庚七醇进行了强烈的标记（volemitol in the genus primula - distribution and significance. zeitschriftfür pflanzenphysiologie 1978, 86:453-461）。底栖褐藻pelvetia canaliculata中也含有大量的庚七醇（0.85-3%产率）。
6、迄今为止，只有一篇50年前发表的科学文献是关于微生物合成庚七醇的报道。由酵母(torulopsis versatilis)对乳糖进行好氧异化的微生物发酵可以生成庚七醇，但其产率根据乳糖的消耗量在1.1-3.3%之间变化，远未达到实际应用价值（the production ofd-glycero-d-manno-heptitol by torulopsis versatilis. can j microbiol 1972,18:925-927）。因此本发明需要开发一种新的庚七醇生产策略。
7、因此，有必要研发一种能合成庚七醇的解脂耶氏酵母菌，以解决上述问题。
技术实现思路
1、针对现有技术中的不足之处，本发明的目的在于提供一种能高效合成庚七醇的解脂耶氏酵母菌，从而实现庚七醇的高效合成。
2、为了达到上述目的，本发明技术方案如下：
3、一种能高效合成庚七醇的重组解脂耶氏酵母菌株，其特征在于，所述解脂耶氏酵母菌株分类命名为解脂耶氏酵母cgmcc no.7326δ tal，保存于中国普通微生物保藏中心，所述解脂耶氏酵母菌株的保藏编号为cgmcc no. 31033。
4、本发明的另一个目的在于克服现有生产庚七醇方法的不足之处，提供一种高效合成庚七醇的重组解脂耶氏酵母的工程菌株的构建方法。
5、为了达到上述目的，本发明技术方案如下：
6、本发明通过代谢工程、基因工程的手段，将原有的合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母进行改良，使得该酵母能够利用葡萄糖等碳源直接发酵合成庚七醇，再从发酵液中提取纯化得到庚七醇粉末性结晶体；
7、本发明通过代谢工程改良手段，对该解脂耶氏酵母进行基因操作，敲除合成赤藓糖醇的部分基因，阻断合成赤藓糖醇的代谢途径，增强合成庚七醇的途径，从而使得重组的解脂耶氏酵母能由葡萄糖等碳源直接发酵合成庚七醇。采用代谢工程的手段得到由葡萄糖等碳源直接发酵合成庚七醇的工程菌株；并从构建的菌株中优选获得一株合成庚七醇能力最高的解脂耶氏酵母（yarrowia lipolytica）cgmcc no.7326δtal，保藏编号为cgmcc no.31033。本发明还提供采用该菌株由葡萄糖发酵合成与纯化庚七醇的方法。
8、本发明具体是通过以下技术方案来实现的：
9、本发明涉及一种能高效合成庚七醇的重组解脂耶氏酵母菌株的构建方法，是以能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母菌株（yarrowia lipolytica，之前称为candidalipolytica）为底盘微生物，通过代谢工程、基因工程的手段，构建以葡萄糖、果糖、甘油中的一种或几种为碳源发酵高效合成庚七醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法。该方法能显著降低合成赤藓糖醇的代谢途径，增强合成庚七醇的途径。
10、作为本发明的一个实施方案，本发明使用的底盘微生物解脂耶氏酵母，可以是基因组中含有与seq id no.1序列具有97%及以上同源性或相似性的dna序列的解脂耶氏酵母菌株。
11、作为本发明的一个实施方案，本发明的构建能合成庚七醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法，包括在底盘微生物解脂耶氏酵母细胞中敲除破坏其自身的转醛酶基因（transaldolase, tal），使得解脂耶氏酵母降低合成赤藓糖醇的前体4-磷酸赤藓糖的能力，获得合成庚七醇的能力。
12、上述转醛酶基因是通过以下方式在解脂耶氏酵母中敲除的，这些方式仅作为示例来说明基因是如何在解脂耶氏酵母细胞中被敲除的，而不是对本发明的限定。
13、（1）敲除载体的构建。
14、分别克隆待敲除基因tal的上下游各1.2-1.5kb序列，二者进行融合，上下游之间插入筛选标记基因（如潮霉素抗性基因等），标记基因两侧分别含有loxp序列，以便回收筛选标记重新利用，便于敲除下一个基因，敲除载体的序列如seq id no.2所示。还可以分别克隆待敲除基因的5’端与3’端400bp的dna序列，二者进行融合，中间插入筛选标记基因，标记基因两侧分别含有loxp序列，以便回收筛选标记重新利用，便于敲除下一个基因。还可以体外直接合成待敲除基因的敲除框。具体在实施例加以说明。筛选标记序列是指抗生素抗性基因如潮霉素抗性基因等，或者营养选择型基因如蔗糖酶基因（suc2，编码产物使得解脂耶氏酵母能利用蔗糖）、木糖醇脱氢酶基因（xdh，编码产物使得解脂耶氏酵母能利用木糖醇）、尿嘧啶核苷酸合成酶基因3（ura3，编码产物使得ura3缺陷型的解脂耶氏酵母能在不含尿嘧啶的基本培养基上生长）等。
15、（2）含目的基因敲除框的转化。
16、将待敲除基因的敲除框转化解脂耶氏酵母（转化方法参考本发明人程海荣发表的论文：journal of functional foods, 2017, 32：208~217），在含筛选标记的培养基中筛选。若敲除框上含有蔗糖酶筛选标记，转化后则将酵母涂布在含蔗糖的ynbs基本培养基上筛选（酵母氮碱6克/升，硫酸铵5克/升，蔗糖10克/升，琼脂粉15克/升，ph6.0）。若敲除框上含有潮霉素抗性基因筛选标记，转化后则将酵母涂布在含潮霉素的ypd-hph培养基上筛选（葡萄糖10克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，琼脂15克/升，潮霉素300微克/毫升，ph6.0）。提取转化子的基因组，用目的基因上的一对引物扩增，若未能扩出相应大小的条带，说明目的基因已经被从解脂耶氏酵母基因组中敲除，若能扩出相应大小的条带，说明目的基因未从解脂耶氏酵母基因组中敲除。最终获得敲除转醛酶基因的解脂耶氏酵母。
17、采用上述构建能合成庚七醇的重组解脂耶氏酵母的方法，获得的能由葡萄糖等碳源高效合成庚七醇的重组解脂耶氏酵母菌株， 通过上述分子生物学的操作，获得一系列解脂耶氏酵母的突变株。
18、通过发酵筛选，在250毫升摇瓶中进行发酵培养，最终获得一株合成庚七醇产量最高的重组解脂耶氏酵母菌株，该菌株保存于中国普通微生物保藏中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2024年6月21日，保藏编号为cgmcc no.31033，拉丁文名称为yarrowia lipolytica。
19、为了进一步验证是否具备应用价值，在中试发酵罐中进一步发酵测试。中试发酵罐可以是3-50升容量的发酵罐，也可以是其它容量更大的发酵罐如200升发酵罐。
20、本发明还涉及利用esi-ms、核磁共振氢谱（1h nmr），核磁共振碳谱（13c nmr）和x射线单晶衍射等手段对庚七醇进行表征，以鉴定合成的是真正的庚七醇。电喷雾电离质谱(esi-ms)是用岛津公司的lcms-2010质谱仪(shimadzu corporation, japan)采集，数据信息以最高丰度的同位素的质荷比（m/z）展示。核磁共振氢谱（1h nmr）是在bruker avance400光谱仪(bruker, germany) 上 400 mhz核磁共振频率下采集，核磁共振碳谱（13c nmr）是在bruker avance 600光谱仪(bruker, germany)上600 mhz核磁共振频率下采集。氢谱和碳谱以ppm为单位的化学位移(δ)展示：多重性(s：单线态；d：双线态；t：三重态；dd：双重的双重态；m：多重态)。x射线单晶衍射用bruker d8 venture cmos photon ii衍射仪在173k下采用helios mx多层单色cu kα辐射(λ = 1.54178 å)采集x射线单晶衍射数据。使用apex3 v2019.11-0进行数据收集、晶胞细化和数据约简。用shelxl-2018/3程序包采用本征相位法求解结构，并在具有各向异性位移参数的f2上采用全矩阵最小二乘法进行非h原子的细化。对附着原子氢原子采用具有各向同性位移参数设置1.2xueq（甲基氢原子参数设置1.5xueq）来计算碳原子上氢原子的理想位置。详细的说明请见实施例2。
21、本发明还提供一种应用该菌株直接发酵合成与纯化庚七醇的方法，所述的方法包括以下步骤：
22、s1、将获得的能合成庚七醇的解脂耶氏酵母突变菌株培养于含碳源、氮源以及水的培养基中，在初始ph值为3.0～7.5，温度为30±3℃条件下振荡或者搅拌通气发酵培养，发酵结束后菌液分离得到富含庚七醇的发酵液与酵母菌细胞；
23、s2、从所述含庚七醇的发酵液和/或酵母细胞中分离纯化得到庚七醇。
24、上述步骤s1中，培养过程中根据需要，添加少量的消泡剂或者不添加消泡剂。
25、上述步骤s1中，发酵培养过程中，每隔一段时间取样检测原料碳源如葡萄糖的剩余量与产物庚七醇的生成量，当碳源如葡萄糖消耗完后停止发酵。
26、上述步骤s1中，所述培养基中的碳源可以为葡萄糖、果糖、甘油中的一种或几种，所述碳源用量为200～300克/升，优选250-300克/升，最优选300克/升。
27、上述步骤s1中，所述培养基中的氮源为酵母浸粉、酵母浸膏、蛋白胨、玉米浆干粉、磷酸氢二铵、柠檬酸铵、氨基酸中的一种或几种的混合。所述培养基中氮源含量为10～25克/升，优选10-18克/升，最优选14克/升。
28、上述步骤s2中，所述分离纯化包括：菌液分离得到澄清含庚七醇的发酵液、浓缩得到富含庚七醇的浓缩液、一次结晶得到庚七醇粗制品、粗品重溶、离子交换去除离子、脱色、浓缩、二次结晶得到庚七醇精制品、干燥。
29、所述菌液分离为：发酵液离心或者膜过滤等菌液分离方法分离去除菌体，菌体加入水漂洗两次或以上以充分回收其中的庚七醇，得到澄清含庚七醇的发酵液。
30、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
31、本发明通过对解脂耶氏酵母进行代谢工程的改造，由于敲除了tal基因，使得解脂耶氏酵母大幅降低合成赤藓糖醇的前体4-磷酸赤藓糖的能力,积累7-磷酸景天庚酮糖并获得合成庚七醇的能力，从而能够直接发酵葡萄糖、甘油等单一或复合碳源一步发酵生产庚七醇。
32、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
1.一种能高效合成庚七醇的重组解脂耶氏酵母菌株，其特征在于，所述重组耶氏酵母菌株分类命名为解脂耶罗维亚酵母yarrowia lipolytica cgmcc no.7326δtal，保存于中国普通微生物保藏中心，所述重组耶氏酵母菌株的保藏编号为cgmcc no. 31033。
2.一种能高效合成庚七醇的重组解脂耶氏酵母菌株的构建方法，其特征在于，以解脂耶氏酵母菌株为底盘微生物，通过代谢工程或基因工程手段，构建直接发酵合成庚七醇的重组解脂耶氏酵母菌株的方法，所用的碳源为葡萄糖、甘油中的任一一种或两种的混合。
3.如权利要求2所述的能高效合成庚七醇的重组解脂耶氏酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述底盘微生物为基因组中含有与seq id no.1序列具有97%以上同源性的dna序列的解脂耶氏酵母菌株。
4.如权利要求2所述的能高效合成庚七醇的重组解脂耶氏酵母菌株的构建方法，其特征在于，在底盘微生物解脂耶氏酵母细胞中敲除其自身的编码转醛酶的基因tal，减弱合成赤藓糖醇的能力，经发酵筛选后得到具备合成庚七醇的能力的重组解脂耶氏酵母菌株。
5.一种应用解脂耶氏酵母菌株合成庚七醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.如权利要求5所述的应用解脂耶氏酵母菌株合成庚七醇的方法，其特征在于，步骤s1中，所述培养基中的碳源为葡萄糖、甘油中的一种或两种混合，所述培养基中的碳源含量为200～300克/升。
7.如权利要求5所述的应用解脂耶氏酵母菌株合成庚七醇的方法，其特征在于，所述培养基中的氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、磷酸氢二铵、柠檬酸铵中的一种或几种的混合，所述培养基中的氮源含量为10～25克/升。
8.如权利要求5所述的应用解脂耶氏酵母菌株合成庚七醇的方法，其特征在于，步骤s2中，所述分离纯化包括：菌液分离得到澄清的含庚七醇的发酵液，浓缩得到富含庚七醇的浓缩液，一次结晶得到庚七醇粗制品，粗制品重溶、离子交换去除离子、脱色、浓缩、二次结晶得到庚七醇精制品，干燥。
