本发明涉及一种基于凝集素亲和的灭活病毒疫苗制品的糖基化的检测方法，属于糖基化检测分析。
背景技术：
1、蛋白质糖基化是蛋白质常见的翻译后修饰方式，蛋白质通过在内质网和高尔基体的糖基化修饰系统在特异位点被赋予单糖或寡糖链，因此具有多种生物学功能。超过一半的生物药制品均经过糖基化修饰，包括单克隆抗体、融合蛋白、细胞因子、重组蛋白疫苗以及灭活病毒疫苗。
2、目前主要有液相色谱法、质谱法(ms)、凝集素阵列等主流糖组学分析手段。
3、液相色谱法通常是事先将n聚糖糖链用糖苷酶从糖蛋白上消化下来，再用吸附柱富集糖链，接着使用荧光试剂(通常是2-氨基吡啶)标记，最后使用液相系统进行分离和分析。该方法分离原理基于聚糖化学结构的差异；即在正相(亲水作用)色谱中，分离主要取决于每个聚糖的大小(大致是羟基的数量)，而在反相色谱中，分离则基于每个聚糖的疏水性，但实际机制要复杂得多。该方法基本上适用于吡啶酰胺化后的各种聚糖，而且已被证明能够鉴别大于500个聚糖，但是每次色谱分析单个样品需要的时间相对较长(通常为1小时)，因此通量较低；前期处理需要进行糖链的消化、富集和标记，操作复杂且耗时，每一步操作都会造成糖链损失或污染影响最终实验结果，其实验稳定性取决于操作人员的实际操作能力，对于病毒样品本身较为稀少，成分复杂，没有办法像单纯的蛋白样品实现有效的糖组消化和富集；并且需要购买样品处理试剂盒，所用试剂含剧毒，且价格昂贵，还需要液相系统配备荧光检测器，因而检测成本较高。
4、质谱法对复杂聚糖的适用性首先是通过串联质谱技术实现的。该方法对于确认和估算包括氨基聚糖在内的聚糖结构非常有用，并在准确性(分辨率)方面具有一定的优势。但质谱法不仅需要对复杂样品进行预处理(包括蛋白变性、酶切)等，也不能单独揭示成分糖的特性，后续的数据处理也非常复杂，且由于质谱仪器价格昂贵，不适用于普通实验室的开展。
5、凝集素阵列是一种利用固定在固体表面的凝集素组对聚糖和糖蛋白进行高通量分析的新平台。凝集素微阵列可以通过分析多糖和多种凝集素之间的生物化学相互作用来评估糖蛋白和细胞糖基化的整体特征。该方法优势在于易于操作，高通量，快速的特点。但其对于样品纯度和浓度有较高要求，仅适用于经纯化后的蛋白质溶液，对于蛋白浓度不高的病毒纯化液难以进行准确的检测；且其不具备特异性，凝集素阵列芯片对糖和糖蛋白极度敏感，因此凝集素阵列固体表面的凝集素会捕获样品中的可能存在的糖蛋白对结果造成影响。此外，采用此方法进行检测需要购买凝集素阵列芯片以及相配套的仪器设备，检测成本高。
6、灭活病毒保留了病毒的抗原蛋白质，去除了病毒的致病性，会促进免疫细胞针对抗原蛋白质产生特异性抗体，从而达到预防或治疗病毒的目的。通常情况下，灭活病毒的抗原蛋白质均为糖蛋白，糖链连接在蛋白质上能够确保蛋白质的适当折叠并保护抗原表位免受免疫细胞或抗体识别。而由于，单糖或寡糖链修饰缺乏固定模式，结构多样化，且灭活病毒通常为病毒颗粒，即多个病毒蛋白的多聚体结构，蛋白质种类通常有数种或数十种、成分较为复杂，与单一蛋白质样品不同，病毒类样品浓度较低通常仅为单一蛋白质样品的百分之一或千分之一，因此分析较为困难，其糖基化修饰分析方法仍需深入研究。当前疫苗生产主要以病毒类疫苗制品为主，考虑到糖组对于病毒类疫苗制品的免疫原性的影响，以后的病毒类疫苗制品可能需要进行糖组成分含量的检测作为质量控制手段，因此需要建立一套有效、便捷且快速的鉴定方法用于病毒类疫苗的质量控制。
技术实现思路
1、发明要解决的问题
2、本发明的目的是为了解决灭活病毒类生物制品中蛋白质糖基化修饰特征的检测难题，提供了一种灭活病毒糖基化修饰特征快速检测的方法，其不仅操作简便、成本低，同时准确度和重复性较高，具备良好的生物制品检测应用前景。
3、用于解决问题的方案
4、为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：先制备特异性抗体包被的微孔板用于富集样品中的靶向蛋白，后加入灭活病毒样品于微孔板内进行捕捉和富集，将荧光素标记的凝集素按需要分别加入微孔板中，再使用多功能酶标仪，利用495nm的激发光照射微孔板，检测其521nm处的发射光荧光强度。通过分析cona孔与aal、ltl、gs-ii、eca、psl各孔荧光值的比例关系，得出靶向分子的糖基化修饰情况。
5、本发明基于凝集素亲和开发的灭活病毒疫苗制品糖基化酶联免疫吸附的半定量检测方法，结果显示该方法可以高效、准确、灵敏、低成本且高通量的半定量检测灭活病毒的糖基化特征，使用设备较为常见，损耗样品量较少，操作简便，易于重复，准确率高，有利于疫苗生产过程中的快速检测，及批间差异比对，本发明为灭活病毒疫苗的产业化生产提供了一种稳定、有效、便捷且高通量的糖基化特征差异分析方法，有助于探讨灭活病毒糖链结构的差异化对疫苗免疫原性的影响。
6、本发明提供了一种检测病毒疫苗中蛋白糖基化修饰情况的方法，其中，所述病毒疫苗中包含灭活的病毒颗粒或减毒的活病毒颗粒；
7、所述方法包括：
8、捕获抗体固定病毒疫苗中的病毒颗粒的步骤；
9、凝集素与病毒疫苗中的病毒颗粒结合的步骤；
10、荧光强度测定的步骤；以及
11、聚糖含量计算的步骤方法；
12、优选地，所述凝集素包括con-a；
13、任选地，所述凝集素还包括aal、ltl、gs-ii和eca中的至少一种；
14、优选地，所述凝集素是携带荧光素标签的。
15、在一些实施方式中，在所述捕获抗体固定病毒疫苗中的病毒颗粒的步骤中，病毒疫苗的生物学效价不低于150miu/ml；
16、优选地，所述病毒疫苗的生物学效价为150miu/ml～2500miu/ml。
17、在一些实施方式中，所述凝集素与病毒疫苗中的病毒颗粒结合的步骤包括将经捕获抗体固定后的病毒颗粒与凝集素亲和。
18、在一些实施方式中，所述病毒疫苗中的病毒颗粒具有糖链；
19、可选地，所述糖链由由包含2个n-乙酰葡糖胺和3个甘露糖的五糖核心的n-连接型聚糖组成；
20、可选地，所述五糖核心连接包含葡萄糖、半乳糖、甘露糖和岩藻糖中的至少一种的糖基或糖胺。
21、在一些实施方式中，在凝集素与病毒颗粒结合的体系中，凝集素的其使用浓度高于2.5μg/ml。
22、在一些实施方式中，所述病毒疫苗包括狂犬病疫苗。
23、在一些实施方式中，利用多功能酶标仪测定荧光强度。
24、在一些实施方式中，在激发光波长490～500nm的条件下检测波长510～520nm处荧光强度。
25、在一些实施方式中，按下式计算聚糖含量：
26、聚糖含量(％)＝[凝集素a(平均荧光强度)-阴性对照(平均荧光强度)]/[凝集素b(平均荧光强度)-阴性对照(平均荧光强度)]；
27、所述凝集素a包括aal、ltl、gs-ii和eca中的至少一种；
28、所述凝集素b为con-a；
29、所述阴性对照为未加入病毒疫苗的缓冲液；
30、所述平均荧光强度为设置的至少3组重复实验的荧光强度的平均值。
31、在一些实施方式中，
32、当凝集素a为aal时，可得到病毒颗粒的糖链中末端岩藻糖的占比；
33、当凝集素a为ltl时，可得到病毒颗粒的糖链中支链岩藻糖的占比；
34、当凝集素a为gs-ii时，可得到病毒颗粒的糖链中末端葡糖酰胺的占比；
35、当凝集素a为eca时，可得到病毒颗粒的糖链中末端乙酰半乳糖胺的占比。
36、发明的效果
37、1.本发明所提供的检测方法解决了高效液相色谱、串联质谱此类分析手段技术路线复杂、操作困难、耗费时间等缺点。
38、2.本发明所提供的检测方法解决了凝集素阵列此种分析方法检测成本高昂、靶向性差的缺点。
39、3.本发明所提供的检测方法所采用的试剂仅包括：高结合力微孔板、特异性抗体、荧光标记凝集素和pbs缓冲液，所用试剂易于购买，使用方法简单。检测设备仅为多功能酶标仪，设备成本较低。
40、4.本发明所提供的检测方法极大程度上压缩了实验步骤，简化了实验操作，凝集素孵育结束即可进行检测，具有便捷、高效、准确、重复性好、低成本及高通量的检测灭活病毒糖基化特征。
41、5.本发明所提供的检测方法具有靶向性，使用抗体捕获样品中的病毒，具备较高的检验特异性，可对复杂性生物样本进行分析，例如包含复杂蛋白成分的病毒颗粒。
42、6.本发明所提供的检测方法能够适用于灭活病毒生产过程中的批量化检测，以及批间差异一致性考察；同时，为灭活病毒疫苗类生物制品中的糖基化分析提供有效方式，利于探讨糖基化特征对疫苗免疫原性的研究。
43、7.本发明所提供的检测方法与lc-ms/ms检测方法结果接近，误差不超过±10％，显示出较好的结果匹配度；也可结合质谱数据，针对性地选用荧光标记凝集素进行检测，减少工作量的同时节约资源。
44、8.本发明所提供的检测方法中使用的酶标仪配备多通道荧光检测系统，适用于荧光样品的检快速测，普通酶标仪不具备该检测器，因此需要使用二抗孵育样品后再上机检测。
45、9.本发明所提供的检测方法使用的荧光标记凝集素可以有效缩短操作步骤及时间。
1.一种检测病毒疫苗中蛋白糖基化修饰情况的方法，其特征在于，所述病毒疫苗中包含灭活的病毒颗粒或减毒的活病毒颗粒；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述捕获抗体固定病毒疫苗中的病毒颗粒的步骤中，病毒疫苗的生物学效价不低于150miu/ml；
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述凝集素与病毒疫苗中的病毒颗粒结合的步骤包括将经捕获抗体固定后的病毒颗粒与凝集素亲和。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述病毒疫苗中的病毒颗粒具有糖链；
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，在凝集素与病毒疫苗中的病毒颗粒结合的体系中，凝集素的浓度高于2.5μg/ml。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述病毒疫苗包括狂犬病疫苗。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，利用多功能酶标仪测定荧光强度。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在激发光波长490～500nm的条件下检测波长510～520nm处荧光强度。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于，按下式计算聚糖含量：
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，
